440814

с,ф,тф,пщ-. .-,еюащфъфиФфю эюе щеО П И С А Н И Е (и 44014ИЗОБРЕТЕН ИЯ Оввв Советских Социалистических) Зависимый от патента А 01 д 7/О(32) Приоритет 18.05.71 (31) 15626/71 (33) ВеликобританияОпубликовано 25.08.74, Вюллстень М 31 Госудврственныи комитет света Министров СССРпа делам изабретений и открытий 58.002 (088.8) 53) Дата опубликования описания 11,06.7 72) Авторизобрете ИностранецРоберт Даниэль Маккорник(США)Иностранная фирмаикан Цианамид Компани(54) СПОСОБ П ЕН Изобретение относится к получению химических веществ с помощью культивированиятканей растений, погруженных в жидкуюаэробную среду, а именно к способу получения химических метаболитов растений,Известен способ, заключающийся в выращивании культуры 1 п иваго изолированныхтканей или клеток в контролируемых условиях.При этом ценные метаболиты растенийполучают при культивировании целых корневых органов в условиях аэробного погружения в питательную водную среду так же, каки при получении антибиотиков.Использование известного способа в промышленном масштабе непроизводительно изза трудоемкости его осуществления - возникновения огромной массы растущего нитевидното корневого материала.Целью изобретения является улучшениеусловий для накопления метаболитов,Эта цель достигается тем, что производятредифференциацию растительных ячеек путемснижения ауксин-активности растительныхклеток. Снижение уровня ауксин-активностиосуществляют разбавлением в соотношении1:1 рабочей питательной среды свежей, тойже прописи или введения антиауксин-активного соединения,Способ осуществляют следующим образом.Метаболиты растений получают суспендированием, при этом происходит процесс генерирования исходного органа растений, что 5 приводит к вырабатыванию метаболитов ипонижению уровня ауксин-активности в водной аэробной питательной среде, содержащей растущие недифференцированные клетки клеточных групп названного, растения, погружен ного в эту среду, и культивирования первоначального органа растения до тех пор, пока не получают необходимое количество метаболитов.Производят инокуляции водной питатель ной среды энергично растущими недифференцированными клетками растения, которые вырабатывают метаболиты. Рост недифференцированных клеток осуществляют в питательной среде в течение определенного периода 20 времени в условиях аэробного погруженияв питательную среду в присутствии ауксинактивных веществ в этой среде. Затем уров нь ауксин-активных веществ понижают, в результате чего происходит редифференциа ция клеток растения на наружной части первоначального органа растения при сопутствующей выработке метаболитов. Растущие редифференцированные клетки выдерживают в течение определенного периода времениКомпонент 30 35 40 45 50 95072018522068307420,10,40,1220000100000,1111000111160,06до 1 л 55 60 65 в аэробной среде в погруженном состоянии для получения полностью созревшей массы. Этот рост приводит к накоплению необходимых количеств метаболитов, которые выделяют и собирают.Химическими метаболитами растений, которые могут быть получены описанным способом, являются алкалоиды, такие как стрихнин и бруцин из образцов Ягусйпез; алкалоиды раувольфии из образцов Каичто 111 а а 1 з 1 оп 1 а; винбластин из образцов Сайагапйнз (главным образом %пса), антропные алкалоиды из ряда членов семейства Яо 1 апасеае, камедь из образцов Веа л 1 аг 1 э и :11 а, красители из образцов 1 пйдо 1 ега, К 1 тцэ, Ве 1 а и Лаюзапе и т. д.Для осуществления способа используют водную среду, содержащую один или несколько источников углерода, таких как углеводы или производные жирных кислот, источник ассимилируемого азота, например нитрат-ион или амоний-ион, глицин, мочевину. Предпочтительно применять такие вещества, как глюкоза, сахароза, кукурузный сироп, крахмал, декстрин и другие подобные вещества в качестве источника углерода. Кроме того, питательная среда содержит минеральные соли, например фосфаты, хлориды, сульфаты, металлы (натрий, калий, кальций, магний) и микроэлементы. Микроэлементы обычно присутствуют в виде примесей даже в хорошо очищенных неорганических соединениях,Кроме того, в питательную среду вводят один или несколько обычных витаминов: тиамин, рибофлавин, пантотеновую кислоту и наицин. Эта смесь обеспечивает нормальный рост растительной ткани.Ауксин-активные вещества - вещества фотогормонального действия, регулирующие рост растений.Природными ауксинами, т, е, такими, которые обнаруживают активность при регулировании роста растений и встречаются в целом живущем растении, являются 3-индолуксусная кислота и ее некоторые производные, например, сложные эфиры, гликозиды. Ауксин-активные вещества включают в себя как природные соединения, так и синтетически полученные вещества, обнаруживающие активность, как фитогормональные вещества, промотирующие рост. Ауксин-активные вещества иногда предпочитают в качестве стимуляторов зародышевого развития. Типичные ауксинактивные вещества, применяемые в изобретении, это такие, как 3-индолуксусная кислота, 3-индолмасляная кислота, 1-нафталинуксусная кислота, п-хлорфеноксиуксусная кислота, 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота, 2,4,5-трихлорфеноксиуксусная кислота и т, п. В способе используют также анти-ауксинные соединения, т. е. такие соединения, которые подавляют или нейтрализуют фитогормональную активность ауксин-активных веществ. В качестве типичных анти-ауксинов берут, например, 1-нафтоксиуксусную кислоту, коричную кислоту, тропиковую кислоту, 2,3,5- трийодбензойную кислоту и 2,4,б-трихлорфеноксиуксусную кислоту.П р и м е р 1. Индуцирование роста Ве 1 а чц 1 даг 1 з на нормальном растительном материале с сохранением отвержденной среды.Зерна обычной красной свеклы, Ве 1 а чц 1- даг 1 з сорта Ве 1 го 11 Яе 1 ез 1 с 1 оЬе, проращивают на влажной фильтровальной бумаге и затем полностью осушают, пророщенные зерна стерилизуют погружением в 1%-ный раствор гипохлорита на 5 мин. Начиная с этого момента, все операции с живущими тканями проводят при условии полной асептики. Эту рассаду переносят на влажную стерилизованную фнльтровальную бумагу, в виде кружков разрезают на части: радиальные сегменты, Ьуросо 1 н 1 сегменты и семядольные сегменты, и каждый из этих сегментов переносят в отдельные 1-дюймовые чашки Петри, содержащие по 30 мл среды (табл. 1). Нитрат калияНитрат аммонияСульфат магния гептагидратХлорид кальция дигидратфосфат калияСернистое железо гептагидратСульфат марганца гидратСульфат цинка гептагидратБезводная борная кислотаЧолибдат аммонияЙодид калияСульфат меди пентагидратСахарозаАгарБиотипХолинхлоридНикотиновая кислотаИвозитолПантотсновая кислотаПиродоксинРибофлавинТиамип2,4-Дихлорфеноксиуксусная кислотаКвнетинДистиллированная вода Эту среду стерилизуют в автоклаве в течение 20 мин при давлении пара 15 фунт/дюймя (1 фунт/дюйм 2= 0,070307 кгс/см 2). Инокули,рованные чашки инкубируют при 25 С и пониженном освещении: после трех недель инкубирования на концах нескольких исходных инокулированных образцов видны крупные наро сты. Некоторые чашки оказываются испорченными выросшими плесенью или бактериями, их выбрасывают. Наросты, которые появляются на инокулированных чашках переносят в 100 мл емкости, содержащие по 20 мл той же самой агаровой среды, и инку 44081445 Компонент 95018522068307420,10,40,12200000,110001,01,01,01,01,00,061,0 50 55 60 65 бирование продолжают еше пять недель при тех же условиях. По истечении этого времени появляется достаточный рост, так что подкультуру можно несколько раз переносить в другие емкости.П р и м е р 2, Индуцирование неорганизованного роста в жидкой среде и отбор типа, имеющего желательные ростовые свойства.Из каждой подкультуры в агаре (см. пример 1) отбирают кусочек около 8 мм в диаметре и переносят в склянку Эрленмейера, содержащую 60 мл жидкой среды (состав ее приведен в примере 1, за исключением агара). Эти колбы, содержащие инокулированную жидкую среду, помешают на ротационный встряхиватель, имеющий 120 об/мин и диаметр круга встряхивания 25 мм, и инкубируют при всгряхивапии в диффузном свете в течение четырех недель при 25 С. В конце четвертой недели в разных колбах наблюдаются различные результаты, отражающие степень небрежности при отборе клеток на предыдущей стадии. Некоторые колбы содержат только один большой кусок выроста, в других же имеется один большой и несколько маленьких, очевидно родственной природы, образовавшиеся, по-видимому, как выросты на исходном куске и оторвавшиеся от него в процессе инкубации; в некоторых колбах содержатся разбитые фрагменты, которые сами представляют дальнейшую секретацию клеток.Те колбы, которые содержат небольшие фрагменты, и те, которые содержат фрагменты с различными особенностями, отбирают для дальнейшей подкультуры и после шести таких операций отбора, переноса и выращивания получают клетки, имеющие желательную скорость роста во встряхиваемых колбах и растущие с образованием простых, непигментированных клеток или маленьких агрегатов, менее чем 0,5 мм в диаметре. Эти агрегаты при микроскопическом исследовании не обнаруживают никакой тонкой структуры, т. е. другой, чем компоненты клеток. Скорость роста их такова, что при внесении менее 1 % клеток в колбу за две недели инкубации на ротационном встряхивателе общий процент образовавшихся клеток составляет 20 об. %, Эти свойства сохраняются при последующих переносах массы в ту же среду.П р и м е р 3. Повторный дифференцированный рост первичной растительной культуры, погруженной в аэрируемую жидкость.Содержимому одной из фляжек с диспергированной неорганизованной не пигментированной клеточной культурой Ве 1 а чц 1 даг 1 з позволяют отстояться, и чистую жидкость декантируют и отбрасывают. Осевшие клетки и группы клеток дважды промывают по 60 мл за 1 раз с ауксин-свободной жидкой среды (состав среды приведен в примере 1, за исключением 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислогы и агара), и удаляют жидкость декантадией после оседания клеточного материала,Нитрат калияСульфат магния гептагидратХлорид кальция дигидрофосфат Равные порции промытых клеток затем используют для инокуляции 10 колб Эрлен- мейера, каждая из которых содержит 60 мл свободной от ауксина жидкой среды, после чего эти фляжки инкубируют на ротационном встряхивателе, как описано выше, три недели при 25 С, В течение этого периода инкубации инокулированные клетки и клеточные группы интенсивчо растут и в конце наблюдается редиффсренпиация с образованием пасты из темно-оранжевых или красных частиц, которые при небольшом увеличении микроскопа кажутся состоящими почти целиком из тонких корней исходного растения (первичного), причем каждый из них в изобилии содержит нормальный пигмент, использованный для культивации.П р и м е р 4. Выделение пигмента.Отфильтровывают пасту корней первичного из 10 колб предыдущего примера, причем весь питмент содержится в клеточном материале и его нет в отфильтрованной жидкости, которую отбрасывают. Всю массу клеток распределяют в 500 мл воды и смесь кипятят, при этом пигмент переходит в жидкость. Отфильтровывают и отбрасывают клеточную Нитрат калияСульфат магния гептагидратХлорид кальция дигидратЛигидрофосфат калияСульфат железа гептагидратСульфат марганца гидратСульфат цинка гептагидратБорная кислотаАммоииймолибдатЙодид калияСульфат меди пеитагидратСахарозаБиотииИ иоз итол (мез о)Никотииовая кислотаПантотеиовая кислотаПиридоксииРибофлавииТиамииКииетииХолиихлорид440814 Составитель Л. ПлащинаТехред Г. Васильева Редактор Д. Пинчук Корректор 3, Тарасова Заказ 183/16 Изд,237 Тираж 565 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Типография, пр. Сапунова, 2 массу, а полученный красный фильтрат пропускают через 6-дюймовую колонку с катионообменником Рочех 50;2 Р, который,задерживает почти весь пигмент, находящийся в жидкости в 2-дюймовом слое вверху колонки. Элюацию пигмента производят 1%-ным раствором бикарбоната натрия, а затем пигмент выделяют при подкислении до рН 5, замораживают сухой раствор, и экстрагируют пигмент из замороженного раствора метаиолом. Бетанидин используют в качестве, пищевой краски растительной природы.П р и м е р 5. Рост недифференциированных клеток в виде диопергированной культуры во встряхиваемой колбе.Группы клеток приблизительно 8 мм в диаметре с агаровой поверхности используют для инокуляции каждой из пяти колб Эрленмейера, содержащих по 25 мл жидкой среды следующего состава (табл. 2).Кроме того, среда содержит микроэлементы, сахарозу, витамины, ауксин-активные соединения и цитокины.После инкубирования в течение 18 дней клеточному материалу дают отстояться, отделяют декантацией жидкость, и промывают 8осадок 50 мл свежей, свободной от ауксина,среды, следующего состава (табл. 3),Эту суспензию встряхивают 5 мин, затемснова дают ей возможность осесть и отделя 5 ют и отбрасывают чистую отстоявшуюсяжидкость. Клеточную массу промывают одинраз средой ММ Р по той же методике. 10 Предмет изобретения 1. Способ получения химических метаболитов растений, включающий культуру 1 п чИго,изолированных недифференцированных тка 15 ней или клеток в контролируемых условиях,отличающийся тем, что, с целью улучшения условий для накопления метаболитов,производят редифференциацию растительныхячеек путем снижения уровня ауксин-актив 20 ности растительных клеток.2. Способ по п, 1, отличающийся тем,что снижение уровня ауксин-активности осуществляют разбавлением в соотношении 1: 1рабочей питательной среды свежей, той же25 прописи или введения антиауксин-активногосоединения,