403134

О П И С А Н И Е 403134 Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУЗавпспмьш от патента .а М, Кл, А 611 23100 А 611 3/ООЗаявлено 30,111.1972 , 1765402/30-15) Приоритет 12 Л.1971, М 31213, Япония Государственный комитет Совета Министров СССР оа делам изобретений и открытийОпубликовано 19.Х.1973. Бюллетень ЛЪ 42 Дата опубликования описания 16.111.1974 Авторыизобрстспия Иостра и цы тадаеси Казуга, Ясукие накасе и миОру КавахироЗаявитель СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И НАКТИ ВИ РОВАН НОЙ ВАКЦИ Н Ы ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО АТРОФИЧЕСКОГО РИНИТА СВИНЕЙ2 Изобретение относится к способам производства вакциоы, например, проив инфекционного атрофического рицита свиней,Извсстцы способы получения инактивированной формалином вакци 11 ы против инфекционного атрофического ринита свиней из микроорганизма Вогде 1 е 11 а Ьгопс 1)Вер 1 Са. Однако указанная вакцина не давала стойкого иммунитета,Предлагаемый способ отличается тем, что для приготовления вакцицы используют в качестве исходного материала микроорганизм Вогде 1 с 1 а Ьгопс)Вер 11 са 1 фазы развития, содержащий К-ацтигец и ацтиген, Культивирование микроорганизма осуществляют в питательной среде с добавлением 0,5 - 1 вес.1 о казамицовой кислоты, 0,05 - 0,1 вес.% дрожжевого экстракта и 0,1 - 0,5 вес.% порошкообразного активировацного угля или 0,3 - 1 вес.% анцонообмениой смолы с последующей ицактивацией микроорганизма. Микроорганизм в 1 фазе развития Вогпе 1 е 11 а ЬгопС 11 Вср 1 Са - это граммотрицательпый мцкроо, обнаруживающий на кровяном агаре коккоподобную или коккобациллярпую форму, имеющую капсулы или оболочки, це имеющий или имеющий немного жгутиков, облада 1 ощ 1 тз 1 им 1 сво 11 ствск)п, кзк си;1 ш 1 ая агглю ц 1151 под,1 сйсВием 11 п 1 и-К-сыВОРО 1 ки н М 11 Л 3 и 11 Л 11 С.111)1 51 З ГГЛ 101 И 13 ЦИ 51 ПОД ДЕС 1- вием 1) и-О-сыворотки, обцзруживаюцп 1 й всокО виру,с 1 пОсть при введении в мозг мышей и зЗчптсльную пскротоксичность при внутрикожпом Ввс;1 спии морским свинкам.Анти-К-сыворотка представляет собой кроличью сыворотку, полученную адсорбировапи ем нммуннзировзнюй микроорганизмом в 1фазе рззВитпя 1,роли 1 ьсй сыВОротки микроорганизма в 11 фазе цли нагретого до 100 - 120 микроорганизма в 1 фазе. Микроорганизм 11 фазы представляет собой микроор ганцзм в 1 фазе, потерявший свои капсулыцли Ооолочки. Апти-О-сыВОроткз прсдст 11 вл 51- ет сооой кроличью сыворотку, мю пизирован 1 ую микроорганизмом. Взкци 11 а, получе 11- цая указа пы з спосооом, ОО,зд 11 ст т 1 к 1 м 11 20 сВОйс 1 Взз 11, что, если мынзм Ввести ес Внут.рибрОни 11 ц) и после этого, черсз 10 дней, ввссн В мозг мышей микроорганизм Вогдс 1 с 11 з Ьгопс 11 вср 11 са в дозе 10 - 100 " Дзо (ЛДао - количество микроорганизмов, способ цое убить 50% мьппсй), то мыши пре;охраняются от н 1)екци 1, При ввсде 11 ипакой вакцины мышам илп кроликам . образуютсяантитела (К-а 1 питела), способные сильно агглю 1 инировать микроорганизм 1 фазы (разВ 1 ГГИ 51) .ДЛ 51 получения инактивироваш 1 ой вакцины в соо 1 ве 1 с 1 вии с изобретением в качес 1 ве основной среды используется среда кровяного агара. Э 1 о потому, что наличие или осутствие К-антигона в микроорганизме Вог 1 ес 11 а Ьгопс 11 зер 11 са является важным ключом для повышения защитной силы вакцины, а кровь в среде кровяного агара способствует предохранению от исчезновения К-антигена,Однако трудно обеспечить большое количество крови в производстве вакцины, Изучалась возможность применения К-антигенозащитных ма 1 ериалОВ Взамеп 1 крови и Ок 11 залось, что специфическое сочетание казаминовой кислоы, дрожжевого экстракта и активированного угля или ионообменной смолы лучше, чем кровь, и что вакцина, полученная из микроорганизмов, выращенных в среде, содержащей подобное сочетание, оказывает профилактическое (предохранительное) действие.Употребляемое взамен крови сочетание веществ содержит следующие количества компонентов, вес.%: 0,5 - 1 казаминовой кислоты, 0,05 - 0,1 дрожжевого экстракта и 0,1 - 0,5 порошкообразного активированного угля или 0,3 - 1 анионообменной смолы, из расчета веса твердой или жидкой основной среды, например питательного агара или бульонной среды (питательного бульона), Указанное сочетание вносят вместо крови в основную среду питательного агара или бульона.Инактивированную вакцину получают таким образом, что содержащий К-антиген микроорганизмыфазы Богйе 1 е 11 а Ьгопс 111 зер 1 са выращивают на указанной бульонной или агаровой среде с углем, получая достаточное количество активного вещества, благодаря чему возможно производство вакцины в промышленном масштабе. Полученные клетки убивают или лизат клеток инактивируют путем термической обработки при 50 - 60 С, используя такие химические вещества, как тимерозал (этилмеркурийтиосалицилат натрия) или формалин, или используя физические методы, например ультразвуковой дезинтегратор илн пресс Френча. Полученная таким способом инактивированная вакцина применяется как такОВа 5 или после добаВки аломогеля или масла.Во всех примерах проценты даны в весовом выражении.П р и м е р 1. Содержащим К-антиген микроорганизмом 1 фазы Вордетелла бронхисептика засевают (инокулируОт) среду, получеш 1 ую добавлением 0,5 - 1% казаминОВОЙ кислоы, 0,05 - 0,1% дрожжевого экстракта и О, - 0,5% порошкообразного активированного угля и питательный агар (в качестве основной среды), среду, полученную дальнейшим добавлением 0,5 - 1% полипептона в вышеупомянутую среду, или среду, идентичную по составу вышеупомянутой за исключением того, что вме 5 1 О 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 сто активированного угля дают 0,3 - 1% анионообменнон смолы, и выращивают 48 час при 3(С. Образовавшиеся клетки собирают и переносят в раствор фосфатного буфера с образованием суспензии клеток в конце 1 прации 1 - 200 биллионов/мл. Затем клетки убивают нагреванием суспензии при 50 - 60 С в течении 30 мин или обработкой 0,05 - 1,0 , формалина или 0,01 - 0,2% тимерозала и обработанную таким образом суспензию вместе с 0,01% тимерозала (в качестве консерванта) используют для получения вакцины.П р и м е р 2. Содержащим К-антиген микроорганизмом Вог 1 е 1 е 11 а ЬгопсЬ 1 зер 11 са засевают среду, полученную внесением 0,5 - 1% казаминовой кислоты, 0,05 - 1,0% дрожжевого экстракта и 0,1 - 0,5% порошкообразного активированного угля в питательный бульон В качестве основной среды, или среду, идентичную указанной, за исклочением того, что вместо активировашого угля вносят 0,3 - 1% анионообмешюй смолы, и затем культивируют при взбалтывании или без него 48 час при 37"С. Образовавшиеся клетки отфуговывают, и повторяют ту же операцию (что в примере 1) для получения вакцины.П р и м е р 3. В вакцину из примера 1 вносят алюмогель из расчета, чтобы количество ионов алюминия достигало 2 - 10 мг/мл. Вакцину с такой же эффективностью, как вышеупомянутая, можно получить внесением равного количества масла с целью эмульгирования (вме сто алюмогеля).П р и м ер 4. Аналогично описанному в примере 2 получают культуральную жидкость пу. тем ипокуляции и выращивания К-антигенсодержащего микроорганизмафазы Воге 1 е 1- 1 а Ьгопс 1 т 1 зер 11 са в жидкой среде и инактива цию полученных клеток производят добавлением 0,01 - 0,02% тимерозала, В культуральную жидкость вносят алюмогель в количестве 2 - 10 мг/мл и оставляют до утра при 4 С, после чего снимают надосадочную жидкость для получения вакцины в виде геля, на котором адсорбированы клетки указанного микроорганизма и растворимое денствующее начало,П р и м е р 5. Полученные в примере 1 или 2 клетки разрушают, подвергая их ультразвуковой обработке или обработке на прессе Френча, вносят 0,01% тимерозала и используют для получения вакцины. Ее можно вводить методо ингаляции.Полученную описанным способом вакцину разбавляют до концентрации, эквивалентной 1 - 200 бил/мл, и 1 - 5 мл разведенной вакцины инъецируют 2 - 3 раза или вводят путем ингаляции в носовую полость свинок в возрасте 3 - 30 дней с интервалами в 1 - 3 недели, сОбы обеспечить иммунизацию. Кроме того разбавленную вакцину инъецируют 2 - 4 раза свиноматкам в указанные интервалы и дополнительную инъекцию осуществляют во время беременности с тем, что обеспечить пассивную иммунизацию новорожденным свинкам в эм0 9 63 7 и 21 день после родов21 и 35 день после родов 7-дневная21-дневнаяКонтрольная при употреблении вакцин П р и м е ч а н и е, Цифры в колонках 1 - 4 ир=дставляют результаты, получсииы полученных соответственно в приясрах 1 - 1.) Процент извле- ) Процент атрофии носовой раковиныТитр агглютининачеиия Б. оронлисептика у животных в возрасте 3 - 6 месяцев через 4 неделипосле второйинокуляции Метод инокуляции Группа у животных ввозрасте 6 ме- сяцев до второйинокуляции Ингаляция+ инъекция Инъекция+инъекция АВКонтрольная 50,2113,0(5 0 6,376,2 33 17 80 бриоцальпом состоянии, Взрослых свинок можно иммунизировать, ицъецируя 23 раза 8 - 10 мл упомянутой развелешюи вакцины с интервалами в 1 - 3 недели. Клинический эффект ицактивироваццых вакцин приводится в шжеслс;ующих приме. рах.П р и м е р б. Получеццые в примерах 1 - 4 вакцины разводят до коццеитряции 30 бил/мл, Затем по 1 мл разве;енцой вакцицы вводят внутримышечно соответственно 100 свинкам в возрасте 7 и 21 дця. Через две целели после П р и м е р 7. Подверпутую ульразвуковой обработке вакцину из примера 5 разводят до концентрации 200 бил/мл. Затем 5 мл разведенной вакцины вводят путем ингаляции через носовую полость каждой из 100 свинок в возрасе 8 дней, Через 3 недели полученную в примере 3 алюмогельцую вакцину, разведеццуо до коццепрации 30 бил,мл, вводят вцутримышечцо свинкам в дозировке 2 мл (группа Л). Свинкам второй группы (группа В) вводят ицливидуальцо внутримышечно 2 раза с интервалом в 3 цедели по 2 мл получсшой в примере 3 алюмогельцой вакцицы,П р и м е р 8. Каждую из полученных в примерах 1 - 4 вакцин разводят до концентрации 30 бил/мл, Затем 3 - 10 мл разведенной вакцины вводят внутримышечно 2 - 4 раза свицоматкам с интервалом в 2 - 4 недели с целью иммуцизации, В процессе супоросцости ицьецируют еще 2 - 3 раза по 3 - 10 мл указанной первой инъекции свшкам вводят по 2 мл указаццой рдзведепцой вакцшы. Через 6 месяцев отмечают клшшчсские симптомы цд свшпдх и сравнивают с контрольными, которых це вакцшшровяли. Изучсцис клшшчсских сцмптомов заключается в том, что свицок дцатокизируот через 6 месяцев и проверяют атрофию носовой ракоишы. В табл, 1 привелсцы полу сццыс результаты. 1 з табл. 1 слелу ет, ч 1 о вкнина оец 1 эффск" ии и 1 о .у.шие рсзультаты позу кп, сслп шокуляцшо вакцицы начинать цд цячдльпой стдлип после опороса. 30 развслеццо до сош;ецтрации 30 бил/мл. Затем сравнивают клиическис симптомы у ицокулироваццых свинок и у коцтросьцьх, которых це вакцицировали.Из приведеццых в табл, 2 результатов сле дует, что даже цри ввелеции вдкпшы методомингаляции вакцина успешно повышает титр агглютицицд и эффсктивцд в отцошешш уменьшения атрофии носовой раковины (даже при наличии микробов ицокулировяцпые группы 40 обнаруживают слабые клшические симптомыи невысокий процент атрофии носовой ряковицы, подобно указанному в примере 6). разведенной вакцшы. Как видно из резуль татов, приведеццых в табл. 3, поворождеццыепоросята оказываются высокоиммуцпзировацными; вакцина эффективна в отношении сцижеция процента атрофии цосовой раковины у таки.; поросят по срдвпецио с поросятами от 65 цеицокулировдцпых коцтрольцых свицомдток,Таблица 3 Новорожденные поросята Св номатки Титр агглютииииа зв 1 недслк до опороса Положительнаястспснь атрофииносовой раковиныу одномссячныкпоросят (свинок) Вакцина Кол ичеТитр агглютииинв зв 1 исд лю до опоросаГруппа из примераство800 в 32800 - 6400 800 в 64 800 в 16 8 9 10 8 384941058 1 2 3 4 3 3 3 3 4 4 6400 12800 6400 3200 256:0 12800 25600 12800 6400 в 128 6400 в 128 12800 в 256 6400 в 128 3 3 3 3 1 2 3 4 10 10 10 10 293/10 211 1,10 9 10 11 10 Контрольная 50 5 88 Предмет изобретения Составитель Р. Махнюк Редактор В, Хорииа скрсд Т, Ускова Кг ррскзор Н Аук Заказ 518/19 Изд. М 1015 Тираж 467 . Подписное Ц 11 ИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР ио делам изобрете.ии 1 и окрытии Москва, Я(-35, Рзугисквя наб., и. 4/5Типография, ир. Свпуиовв, 2 1. Способ получения инактивированной вакцины против инфекционного атрофического ринита свиней, включающий выращивание микроорганизма на питательной среде с последующим инактивированием его, от гичаощийся тем, что, с целью получения высокоиммуногенной вакцины, используют в качестве исходного материала микроорганизм Вогс 1 ее 11 а Ьгопс 111 зер 1 са 1 фазы развития, содержащий К-агпигсн и анчигсн.2. Способ по п, 1, от,гичаощийся тем, что выращивание микроорганизма прово,.1 гг на кровяном агаре.3. Способ по и, 1, отличаощийся тем, что в питазельную среду вносят 0,5 - 1 вес.% казаминовой кислоты, 0,05 - 0,1 вес,% дрожже ного экстракта и 0,1 - 0,5 вес,% порошкообразного активированного угля.4. Способ по п. 1, отличаощийся тем, чтов питательную среду вносят 0,5 - 1 вес.% казаминовой кислоты, 0,05 - 0,1 вес.св дРожжс вого экстракта и 0,3 - 1 вес.% анионообменнойсмолы.5. Способ по п, 1, от,гичающийся тем, чтошгактивацию осущесчвляют путем термической обрабочки при 50 - б 0 С.35 б. ( пособ по и. 1, отличающийся тем, чтоинакчивациго осщссчвлягот гимерозалом или формалином,/. Способ по и. 1, от гичаощийся тем, чтоинакз ивацию ос 1 щесз влягот с помощшо зву кового дезигпсгрпора или пресса Френча.