Штамм бактерий escherichia coli продуцент l-гистидина

19) 3 И 1 51) 5 С ОПИС К ПАТЕНТУ РЕТЕНИ ИЕ Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам(71) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов(73) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов и) 2 ООЗ 677 С 1 1 20 С 12 Р 13 24(54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ЕЯСНЕВСНА СОБ - ПРОДУЦЕНТ 3;ГИСТИДИНА(7) Использование; микробиологическая ленность. Сущность изобретения: новы бактерий ЕвсЬепсйасо ВКПМ В - 5945 и -гистидина. Путем введения внеоперонн ций в один из штаммов Е соБ создан и незаменимой аминокислоты З=гистидина.продуцент устойчив к канамицину, стрепто арсенату натрия и позволяет получать 10 З.-гистидина в культурапьной жидкости. 3 промышй штамм родуцент ых мута - родуцент Штамм - мицину и - 12 г/л табл6,052,00,21,02,0 40 Изобретение относится к микробиологической промышленности и биотехнологии и представляет собой штамм бактерий ЕзсЬегсЮэ соИ, продуцирующий незаменимую эминокислоту-гистидин, :гистидин используют в качестве компонента питательных смесей медицинского назначения, как ростовой фактор для ряда продуцентов первичных метаболитов, а также как реактив для биохимическои и фармацевтической промышленности.Существуют различные щтаммы бактерий-продуцентов 1-гистидина, Наилучшим из известных в настоящее время продуцентов-гистидина является штамм бактерий СогупеЬэс 1 егцгп 9 ц 1 агпсот.Этот продуцент был получен в ходе мутагенезэ анэлого-резистентных штаммов, способных накапливать за 72 ч до 13,8 г/л-гистидина (патент США 3713977). Вместе с тем, до настоящего времени неизвестны эффективные продуценты -гистидина на основе Е,соИ. Наилучший штамм Е. соИ продуцирует до 2-3 г/л 1:гистидина за 72 ч ферментации и представляет собой рекомбинантный штамм, который содержит гистидиновый оперон или его фрагменты на мультикопийн ых плазмидэх (патент США 4388405), Этот штамм выбран в качестве прототипа.Недостатком штамма-прототипа явля ется его низкая продуктивность,Представляетсл важным создать на основе наиболее генетически изученного в настоящее время микроорганизма - бактерии Е.соИ продуцент незаменимой эминокислоты -гистидина, который позволяет получать большие количества гистидина.Предлагаемый штамм Е.соИ 24 дает возможность нарабатывать зэ 72 ч ферментэции в лабораторных условиях 10-11 г/л гистидина.Для создания щтамма-продуцента в исходный штамм с мутацией в гене Ыэб вводят ряд внеоперонных мутаций, повышающих экспрессию гистидинового оперона, Этот исходный штамм накапливает в среде за 72 ч ферментации 0,3-0,5 г/л гистидина. Создэнн ый штамм-продуцент Е.соИ 24 отличается от исходного штамма тем, что способен к более эффективной продукции гистидина с высоким коэффициентом конверсии. Данное отличие достигается целенаправленным изменением исходногоштамма, приводящим к усилению транскрипции гистидинового оперона, а также внесением мутэций, обеспечивающих резистентность к стрептомицину и эрсенату натрия. Предлагаемый щтамм позволяет получать 10-11 г/л гистидина зэ 72 ч ферментации в лабораторных условиях при температуре 29-30 С, Гистидин накапливаетсяв культуральной жидкости.Полученный продуцент гистидина Е.соИдепонировэн во Всесоюзной коллекции5 промышленных микроорганизмов под регистрационным номером ВКПБ.Штамм бактерий Е, соИ ВКПМ-продуцент :гистидина имеет следующиекультурально-морфологические и биохими 10 ческие признаки,Культурально-морфологические признаки.Грэмотрицател ьнэя слэбоподвижнаяпалочка с закругленными концами длиной .15 1,5-2,0 мкм. Спор не образует,На полноценной агаризованной среде(агэр Луриэ, агар Хоттингерэ) через 48 чинкубации при 30 С образует круглые беловатые полупрозрачные колонии диаметром20 2 мм, Поверхность колоний гладкая, краяровные, центр колоний приподнят, структура однородная, консистенция пастообраэная, легко эмульгируются.На синтетической среде клетки проду 25 цента требуют витамин В 1, э также 1:пролин,Штамм поддерживают нэ чашках сплотной синтетической солевой средой следующего состава, г/л;30 Глюкоза 10,0Трис-(оксиметил)-аминометэнСульфат аммонияСульфат магния35 Цитрат натрияКалий хлористыйКалий фосфорнокислый одноздмещенный 0,028Тиамин 0,002Пролин 0,1Стрептомицин 1,0Канэмицин 0,05Агар 2045 Вода дистиллированная, л . До 1,рН 7,4-7,6Физиолого-биохимические признаки,Штамм является эуксотрофом по проли 50 ну. Факультативный энээроб. При посевеуколом в полноценный агар хороший ростпо всему уколу, Желэтину не разжижает,Усваивает глюкозу, мальтозу, маннит, галактозу, сорбит, глицерин, Не потребляет саха 55 розу, лэктозу, рафинозу,Устойчив к канамицину, стрептомицину и арсенату натрия. Содержит мутацию по АТФ-фосфорибозилтрансферазе (Ьэс), следствием которой является нарушениеретроингибирования первого этапа биосинтеза гистидином,Усваивает азот в форме аммония, нитратов, а также азот некоторых органических соединений.Растет при температуре 43 С и ниже. Оптимальной для роста является температура 37 С,.а для продукции гистидина 29-30 С.Растет на жидких средах с рН от 6,0 до 8,0, Оптимальное значение рН 7,0.Хранение штамма, Посевной материал смешивают с равным объемом 80-ного глицерина и хранят при -70 С,П р и м е р 1. Введение мутации ЫэТ.В штамм Е,со 11(Ызб) с нечувствительной к гистидину АТФ-фосфорибозилтрансферазой трансдукцией вводят мутантный ген.ЫэТ, Ген ЫэТ кодирует псевдоуридилатсинтазу 1 - фермент, который превращает уридиновые остатки в антикодоновой области тРНК в псевдоуридиновые. Использованная мутация в гене ЫэТ приводит к накоплению тРНК с пониженным содержанием псевдоуридиновых остатков. Наличие в клетках Е. со 11 измененной тРНКвызыЫв вает усиление транскрипции гистидинового оперона. Активация транскрипции происходит, по-видимому, из-за замедления трансляции лидерного пептида аттенюаторной области Ыз-оперона.Трансдукцию проводят с помощью фага Р 1 так, как рекомендовано в руководстве Миллера, У трансдуктантов определяют уровень накопления гистидина в культу- ральной жидкости через 72 ч культивирования. Культивирование проводят так, как описано ниже в примере 3. Среда для культивирования содержит компоненты, перечисленные в примере 3, за исключением стрептомицина, который в данном случае в среду не добавляется, Данные по накоплению гистидина в культуральной жидкости исходным штаммом и штаммом с 91 ЗТ-мутацией приведены в табл,1,П р и м е р 2, Эффект введения мутации по гену грэ 1, который придает клеткам устойчивость к стрептомицину (этгй).,В штамм Е.со 1191 эб" ЫэТ трансдукцией вводят мутантный ген грэ 1, Трансдуктанты становятся устойчивыми к.1-2 мг/мл стрептомицина, Эффект этой мутации на продукцию гистидина проверяют, культивируя трансдуктанты так, как описано ниже в примере 3, Данные по накоплению гистидина в культуральной жидкости приведены в табл.2,П р и м е р 3, Отбор устойчивых к арсе- нату натрия мутантов, Накопление гистиди 1,125 0,01,0,001,2,8,0,51,0 на в культуральной жидкости мутантогоштамма-и родуцента,Биосинтез гистидина - энергоемкийпроцесс, требующий участия АТФ и фосфо 5 рибозилпирофосфата, Для стимуляции образования макроэргических метаболитовподобных АТФ, используют арсенат натрия- токсический аналог неорганического фосфата, Клетки, устойчивые к (АэО) , образу 10 ют большее количество макроэрготическихметаболитов, чем обычные.Отбирают спонтанные мутации, обеспечивающие устойчивость к 4 мМ арсената йа,Затем среди отобранных спонтанных му 15 тантов выявляют такие, которые при культивировании накапливают в культуральнойжидкости гистидина больше, чем родительский штамм,Культивироваие проводят следующим20 образом.Посевную среду инокулируют бактериями, выращенными на минимальной агариэованной среде при 29 С в течение 48 ч.Посевной материал получают выращивани 25 ем в пробирках объемом 50 мл, содержащих2 мл среды, помещенных на термостатируемую круговую качалку(200-240 об/ мин), при29 С в ечение 20 ч. Состав посевной среды,г/л:30 Глюкоза 56Аммонийсернокислый 28Калий фосфорнокислый одно 35 замещенный 2,25Ь 1 агний сернокисл ы й, 7-водн ы йЖелезо (11) сернокислое, 7-водное 0,01,40 Марганец (11)сернокислый,4-водныйТиаминАвтолизат дрожжей45 ПролинСтрептомициВода дистиллированная, л До 1,рН 7,050 Затем о колбу обьемом 250 мл, содержащую 10 глл ферментациоой среды, вносят5% посевного материала и инкубируют акруговой качалке (300 об /ми) при 300 С.Ферметационная среда отличается от по 55 севной среды только добавлением 22 г мелана 1 л посевой среды, По окончании ферментации клетки отделяют центрифугированием, а гистидин определяютколориметрически в культуральой жидкости после хроматографии на пластинках Си2003677 Таблица 1 ли ица Составитель Р,ШакуловТехред М.Моргентал едактор Л.Павлова ТОР П,Гереш аз 3308Ф Тираж ПНПО "Поиск" Роспатента 13035, Москва, Ж-З 5, Раушская на Проиэводствен ательский комбинат "Патент" ород. ул.Гагарина, 10 луфол. Череэ 72 ч ферментации культуральная жидкость содержит 11,6-11,8 г/л гистидина. Данные по накоплению гистидина родительским и арсенат-устойчивым штаммом в культуральной жидкости приведены в табл,3."Формула изобретенияШтамм бактерий ЕзспегсЫа соИ ВКП 3. Аствацатурянц Г,В., Лисенков А.Ф.,Смирнов Ю.В., Шакулов Р.С. Генетика, т.ХХЧ.1988, с, 1928-1934,4. Лисенков В.ФАствацатурянц Г.В.,5 Смирнов Ю.ВЕжель С.АШакулов Р.С.Молекулярная генетика, микробиология ивирусология, 1988, с. 37-43.5. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. ММир, 1976.10 В- продуцент 1-гистидина