Способ определения количества микроорганизмов

)5 АНИЕ ИЗС)БРЕТЕНИ АВТОРСКО ВИДЕТЕЛЬСТВУ Дь Ф Д. ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕВЕДОМСТВО СССР(ГОСПАТЕНТ СССР) 21) 4797551/1322) 03.01,9046) 30.06.93. Бюл. М 2471) Научно-исследовательский институттрансплантологии и искусственных органов72) Б,М,Мануйлов и А.Б.Цыпин56) Авторское свидетельство СССРМ 395439, 1973.Методы общей бактериологии/Под ред.Ф.Герхарда и др. М,; "Мир", 1983, т,1, с.450454. Изобретение относится к медицине и биологии, о частности к микробиологии, иммунологии, санитарии и гигиене,Целью изобретения является повышение точности и разрешающей способности метода эа счет определения любой концентрации и различных микроорганизмов,Для осуществления заяоленного способа необходима видоизмененная камера для счета форменных элементов кроои (камера Горяева), в которой глубину счетной камеры уменьшили со 100 мкм до 4 мкм. Такой размер камеры обусловлен размерами микроорганизмов. Микроорганизмы практически всех видов(кокки и палочки) размещаются в счетной камере с данными размерами, причем одновременно видны о фокусе осе микроорганизмы, находящиеся в камере (чертеж).Уменьшение глубины камеры происходит эа счет уменьшения плотностей. на которых притирают покровное стекло, на 96 мкм, Измененная таким образом камера для счета форменных элементов крови дает воз(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА МИКРООРГАНИЗМОВ(57) Использооднио; биология, медицина,тликробиоло ил, иммунология, санитария,гигиенд. Сущность изобретения: гликроорга-низмы суспендируют о 40%-ном раствореглюкозы, Подсчет микроорганизмов в исследуемой суспензии осуществляют о видоизчененной счетной камере глубиной 4 мкмо фдзово-контрдстном микроскопе, При использовании способа процент ошибки сниждетсл с 30-40 до 3-5 %. 1 ил 2 табл,можность то гно, быстро и дешево определлть любое количество микроорганизмов, причем любых видов (кокки и палочки).Осущесголлетсл способ следующим обрдзом.Перед исследооанием камеру длл счета микроорганизмов и покрооное стекло тщательно моют, обезжириодют и оысушиодют. Затем покровное стекло (толщина, мкм) накладывают на плоскости и притирдют до появленил "колец Ньютона", Подготовленную для работы камеру заполняют рдбочей смесью микроорганизмов, удаляя при этом ее лишнее количество. Рдбочую смесь микроорганизмов готооят следующим образом: К 4,0 мл 40% рдстворд глюкозы добдоляют 0,02 мл суспензии микроорганизмов и тщательно перемешивают. Использование насыщенного раствора высокомолекулярной глюкозы обусловлено тем, что онд способствует фиксации микроорганизмов рдст воре и препятствует их беспорядочному движению, что неизбежно происходи о низкомолекуллрном растворе и значительноза грудняет подсчет. Подсчет микроорганизмов проводят в фазово-контрастнОм микроскопе под иммерсионной системой при увеличении ОВх 90, ОКх 7-10 в 5 больших квадратах счетной сетки по диагонали,Учитывая, что обьем используемой камеры после уменьшения ранен 1(100000 мл / 1/20 х 1/20 х 1/250) расчет количества микроорганизмов проводят по следующей формулеАх 10000 х БВгде Х - количество микроорганизмов в 1мкл;А - количество микроорганизмов в 5больших квадратах;100 000 - постоянное число для перевода обьема камеры к 1 микролитру,Б - степень разведения;В - количество малых квадратов,Например, А = 10, Б = 200, В - 80, тогда10 х 100 000 х 200 5 10 б80- 5 х 10 микроорганизмов в 1 мкл,Процент ошибки при подсчете микроорганизмов в данной камере такой же,как ипри подсчете клеток крови в камере Горяева,и равен примерно 3 - 5 О/,.После определения количества микробов в исследуемой суспензии в последнююпосле соответствующих расчетов добавляют необходимое количество исходной суспенэии микроорганизмов (еслимикроорганизмов меньше необходимойконцентрации) или физиологический раствор (если микроорганизмов больше необходимой концентрации). В полученнойсуспензии определяют количество микроорганизмов и если оно соответствует рабочей концентрации, то используют всоответствующих исследованиях. Если жеколичество микроорганизмов больше илименьше необходимой концентрации, то повторяют выше описанную процедуру довода и контроля количества микроорганизмовеще раз до необходимой концентрации.Обычно если расчет и разведение физиологическим раствором или добавление исходной суспензии микроорганизмовпроводится точно и аккуратно, то необходимое количество микроорганизмов в рабочейсуспензии получают с первого раза. Полученную таким образовал рабочую сусг 1 ензиюмикроорганизмов с заданной концентрацией используют в необходимых исследованиях,П р и м е р 1. Определение и доведениеколичества микроорганизмов до необходимой концентрации и в оптимальном варианте. Однодневную культуру золотистого55 от 1 до 2-3 мкм 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 стафилококка штамм "Лепин" смывают с питательной среды 10,0 мл физиологического раствора (микроорганизмы убивают путем нагревания в течение 2 часов при +70 С, а затем их разбавляют физиологическим раствором до приблизительно необходимой концентрации(1 х 10 в 1 мкл под контролембглаза по мутности (оптической плотности) раствора. После этого суспензию разводят в 200 раэ в 40 растворе глюкозы, путем добавления 0,02 мл разбавленной суспензии микроорганизмов к 4,0 мл 40 6 раствора глюкозы и тщательно перемешивают. Полученной рабочей смесью микроорганизмов заполняют видоизмененную камеру для счета форменных элементов крови с высотой 4 микрона. При этом высокомолекулярный раствор глюкозы в концентрации 40.",ь препятствует беспорядочному движению микробов. Далее считают количество микроорганизмов в 5 больших квадратах по диагонали счетной сетки камеры в фазово-контрастном микроскопе под иммерсионной системой при ОБх 90, ОК х 7-10, В 5 больших квадратах (или 80 малых) находилось 8 микроорганизмов. Следовательно, количество микроорганизмов равноХ 8 х 100000 х 200 2 10 б- 2 х 10 в 1,0 мкл.80То есть количество микроорганизмов в 2 раза больше необходимой концентрации. Для приведения концентрации микробов до необходимой величины суспенэию микроорганизмов разводят физиологическим раствором в 2 раза и проводят дополнительный контрольный подсчет микроорганизмов как описано выше. Количество микроорганизмов в 5 больших квадратах равнялось 4. Следовательно, количество микроорганизмов равно4 х 100 000 х 200 1 10 б80- 1 х 10 в 1,0 мкл. Полученная таким образом рабочая суспензия микроорганизмов с необходимой концентрацией (1 х 10 в 1,0 мкл) готова к употреблению в исследовательской работе.П р и м е р 2, Уменьшение высоты счетной камеры до 3-1 мкм.Уменьшение высоты счетной камеры до 3-1 мкм невозможно, ибо в таком случае будет весьма затруднено, а для некоторых микробов вообще невозможно, заполнение счетной камеры суспензией микроорганизмов, размеры которых в среднем варьируют П р и м е р 3, Уменьшение высоты счетной камеры больше 4 микрон,Уменьшение высоты счетной камеры больше 4 микрон нецелесообразно, ибо при этом фокус микросод лпч плсположенных в расположенных в разных плоскостях микроорганизмов будет различным, что значительно затрудняет подсчет микроорганизмов. Таким образом, чем выше глубина камеры. тем больше разница в фокусе микроскопа для микроорганизмов, расположенных в разных плоскостях, тем сложнее и менее точно происходит подсчет микроорганизмов.Сравнение конечных результатов (т.е. подсчитанное количество микроорганизмов в единице объема рабочей суспензии), полученных при использовании способа-прототипа и заявленного способа показано в)табл.1. В способе-прототипе количество микроорганизмов в рабочей суспензии определялось одним исследователем с помощью соответствующего стандарта мутности на 1,0 х 10 в 1,0 мкл, Определение проводилось трижды, а контролировалось с помощью заявленного способа. Следует отметить, что определение количества микроорганизмов с помощью способа-прототипа разными исследователями неизбежно приводит к еще большему процентному ошибки эа счет субъективной оценки оптической плотности рабочей и эталонной суспенэии микроорганизмов, проводимой под контролем глаза разных исследователей, Подтверждением этого являются результаты, представленные в табл,2.Сравнительный анализ способа-прототипа и заявленного способа показал, что в заявленном способе процент ошибкипри подсчете количества микроорганизмов значительно меньше. чем в способе-прототипе.и соответствует 3-5;(,; в способе про тотипе процент ошибки составляе 30-40;в заявленном способе возможно быстрое, точное и дешевое определение любой концентрации ликроорганизмов в способе- прототипе возможно определение только "0 стандартного (эталонного) количества микроорганизмов;в заявленном способе возможно весьмадлительное использование камеры для счета микроорганизмов; в способе-прототипе необходима замена стандарта мутности по истечению срока гарантии,Использование предлагаемого способапозволяет достаточно точно(процент ошибки составляет 3-56), быстро и дешево опре делять любое существующее количествовсех видов исследуемых микроорганизмов кокки и палочки). Формула изобретения25 Способ определения количества микроорганизмов путем их суспендирования в жидкой среде и подсчета в счетной камере, под микроскопом, о т л и ч а ю щ и й с я тем, 30 что, с целью повышения точности способа,микроорганизмы суспендируют в 40-",ь-ном раствора глюкозы, а подсчет проводят в счетной каплере глубиной 4 лкм.1824445 Таблица 2 Контрольное определение количества микроорганизмов (81 эрп. ацгеце штамм "Лепин"), проведенное в одной и той же пробе с помощью способа-прототипа и предлагаемого способа разными исследователямило эни еда Заказ 2216 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ С 113035, Москва. Ж. Раушскэя наб,. 4/5 Произеодственн-издательский комбинат "Па.Гагарина, 10 жго иомр сте Поверхности дяяпритерэния помроиного ст Составитель Б.МануйловТехред М.Моргентал Корректор А,Козо