Штамм гриба аlтеrnаriа solani sorauer, используемый для селекции томатов на устойчивость к альтернариозу

(71) Институт экологической генетики АНМССР и Институт биоорганической химииим. М.М. Шемякина(56) Мелиян Л,Г. и др, Действие токсичныхметаболитов А(тегпаг(а зо(ап на прорастание пыльцы и семян томатов. Сборник "Влияние фитопатогенов на репродуктивнуюсистему растений-хозяев". Кишинев, 1989,с, 65-65,Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к селекции томатов наустойчивость к ранней листовой пятнистости.Цель изобретения - штамм гриба, предназначенный для повышения устойчивоститоматов к альтернариозу,Описание штамма ВКМ Р - 3236 Д.Штамм выделен из растения томатаусорегз(соп езсц(епт(ип МН, сорта "Ранний83" в теплице с пленочным покрытием Молдавского НИИ овощеводства.Штамм был выделен путем снятия одной диктиоспоры (диктиоконидии) гриба синфекционного пятна при помощи стерильной тонкой иглы и перенесения споры настерильное агаризованное пивное сусло,Штамм идентифицирован по оп елю: Ез М, Бежатасео(з НурЬоКеа: СоевовчеаЮ Ацг(с, Вогеоц, 1 2(54) ШТАММ ГРИБА А ТЕКМАЪА 30.АИ ЯОЯАОЕВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ ТОМАТОВ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К АЛЬТЕРНАРИОЗУ(57) Использование: сельское хозяйство, селекция томатов на устойчивость к альтернариозу. Сущность изобретения: штамм микромицета Атегпага зоап Зогаоег выделен из растения томата. Депонирован в ВКМ под М ГД. Штамм выращивают глубинно на среде Чапека-Докса, затем фильтруют культуральную жидкость, подкисляют до рН 3,0 - 3,5, экстрагируют равным объемом хлороформа. Полученный экстракт штамма используют для селекции томатов на устойчивость к альтернариозу, 2 табл,Для использования штамм выращивают на жидкой среде Чапека-Докса в течение 12-70 суток. Минимальное время культивирования используют в случае погруженной: ф культуры, например, на роторных встряхивателях. Максимальное время роста используют в случае стационарной культуры.Для уверенной идентификации штамм - СО его выращивают на живых листьях томатов; - ф Мицелий осторожно втирают в листья и ос- ОО тавляют во влажной камере при обычных условиях и рассеянном дневном освещении ф, на срок 10 - 14 суток. При этом на листьях образуются инфекционные пятна, некоторые из которых покрыты редкими диктиоконидиями, типичными для вида.Для поддержания культуры в обычных - ф лабораторных условиях, ее выращивают на стандартных агаризованных питательных средах, например, сусло-агаре, При этомидентифицируют па серой окраске мицелия, 1818041темной окраске низа колоний (причем, пигмент часто диффундирует в питательную среду), а также присутствию (редкому) спороношений. Главным признаком штамма ВКМ Г - 3236 Д, отличающим его от других 5 штаммов вида Атегпаг 1 а эоап 1, является спектр липофильных низкомолекулярных экэометаболитов, который можно определить с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, Особенности спектра "0 описаны ниже.Культурально-морфологические свойстваХарактеристика колоний на плотнойсреде,15При росте на стандартной среде Чапекапри 24 С колонии штамма имеют морфологию, типичную для данного вида: колонииширокорастущие, за 8 - 10 суток роста диаметр достигает 40 мм, эа 60 суток - 220-250 20мм. Колонии темно-серые с оливковым оттенком, поверхность стареющих культур часто приобретает белесый налет с каплямибесцветного экссудата, На агаризованномпивном сусле этот экссудат имеет янтарную 25окраску, При росте на жидких и агаризованных средах часто выделяется темный пигмент, который диффундирует в среду.Тип вегетативного тела - мицелий.Субстратный мицелий. 30Среда, Т, возраст,.условия роста: сусло-агар, 20 С, 10 суток, рост мицелия изодной диктиоконидии, выделенной с листатомата при искусственном заражении.Гифы под микроскопом темно-окрашенный, септированные, диаметром 4 - 10 мкм,анастомозирующие, иногда встречаютсяхламидоскопы. При росте мицелия из диктиоконидий субстратный мицелий образуетмикросклероции. 40Воздушный мицелий.Среда, Т, возраст, условия роста: сусло-агар, 20 С, 10 суток, рост мицелия издиктиоконидии.При моноспоровом рассеве воздушный 45мицелий встречается не у всех иэолятов,Цвет воздушного мицелия оливково-серый,гифы в части, прилегающей к субстрату, темно-окрашенные, их воздушные концы частобесцветные, Иногда встречаются вздутые 50клетки овальной формы, а также хламидоспоры. Гифы септированные,Тип размножения,Вегетативное (обломками мицелия) и 55 конидиальное.Покоящиеся структуры.Микросклероции, хламидоспоры, диктиоконидии, алевриоконидии.Бесполое размножение. Типичные диктиоконидии образуютсяна листьях томатов при искусственном заражении, Они имеют форму тонкой морковкис длинным отростком. Наиболее крупныеконидии достигают 250-300 мкм в длину,считая вместе с отростком, и 20-25 мкм вдиаметре. В культуре также изредка образуются диктиоконидии; главным образом покраям чашек Петри, в местах контакта мицелия и стенок чашек. Диктиоконидии в культуре имеют меньшие размеры и частодеформированы, либо редуцированы до цепочки хламидоспор, Конидиеносцы морфологически не выражены.Хламидоспоры - интеркалярные, темноокрашенные, - довольно часто образуютсяв культуре, Они могут встречаться поодиночке, либо образовывать цепочки и сростки,Алевриоконидии (ранее у данного видане отмеченные) имеют сферическую форму,диаметр 30 - 40 мкм, орнаментированнуюповерхность,Артроконидии (ранее у данного вида неотмеченные) образуются по голоартрическому типу, и их трудно отличить от форагментов ми цел ия.Последние два типа конидий встречаются в культуре крайне редко, и обнаружить ихпри обычном микроскопическом исследовании, как правило, не представляется возможным,Кроме диктиоконидий, все типы спороношения могут образовываться в темноте,Половое размножение,Не отмечено.Физиолого-биохимические свойства.Тип катаболиэма: дыхание.Симбиотропные отношения: не выявлены,Отношение к:кислороду - аэроб.Температура роста: максимальная 3032 Соптимальная - 20-424 С, минимальная не выявлена.рН; оптимальное значение 6 - 7, нормальный рост культуры наблюдается призначениях рН 4-8, ингибирующие роСт значения рН не выявлены, Другие характерныефизиологические особенности не выявлены,Маркерные признаки штамма и методыих выявления,Маркерным биохимическим признакомштамма является состав экстракта, выявляемый, например, с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ),Выявление маркерного признака про-.водят следующим образом. Культуру грибавыращивают на жидкой среде Чапека-Доксав погруженной культуре на роторных встряхивэтелях при 90 - 110 об/мин. Температура культивирования 20 - 22 С, срок - 12 - 16 суток. Затем отделяют культуральную жидкость, подкисляют ее до рН 3 - 3,5 и зкстрагируют хлороформом, После отгонки 5 растворителя на роторном испарителе при температуре бани 40 - 50 С получают остаток, называемый экстрактом. Идентификацию состава экстракта проводят с помощью ВЭЖХ. ВЭЖХ осуществляют с помощью 10 хроматографа РО 4100 на колонке с обращенной фазой Оспгозого ВР 18 ,5 мкм) размером 250 х 4,6 мм при температуре 40 С в градиенте от смеси метанол-вода 1:5 до 100 ф, метанола в течение 40 мин при скоро сти растворителя 1 мл/мин. Полученные фракции идентифицируют при помощи спектрофотометрического детектора при длине волны 275 нм. При этом отдельные фракции маркированы по временам удер живания на колонке прибора (мин.); 2,31, 5,82, 14,29, 16,50, 19,06, 22,43, 23,95, 28,54, 31,54, 33,79.Гено- и хемотаксаномические характе-. ристики. Не имеются. . 25Непатогенен для человека и животных, П р и м е р 1. Штамм ВКМ Р - 3236 Д выращивали в погруженной культуре на среде Чапека-Докса, В колбы Эрленмейера емкостью 300 мл наливают по 150 мл среды, 30 автоклавируют 40 мин при 0,5 - 0,6 атм. избыточного давления, затем после охлаждения инокулируют мицелиальными дисками диаметром 10 мм. Диски вырезают.у краев семи-десятисуточных колоний гриба, вы росших на агэризованном пивном сусле. Колбы с грибом помещают на роторные встряхиватели Р/О - 4 при интенсивности встряхивания 90 - 120 об/мин, Спустя 12 суток инкубэции купьтуральную жидкость от фильтравывают, подкисляют до рН 3-43,5 и экстрагируют равным объемом хлороформа. После отгонки хлороформа на роторном испаритепе получа ют экстракт штамма ВКМ Е - 3236 Д, который используют в селекции 45 томатов нэ устойчивость к альтернариозу.Семена томатов сортов Молдавский ранний, Ранний - 83 и Ликурич проращивали в присутствии водного раствора экстракта А,за апВ КМ Е - 3236 Д в концентрации 50 0,10. Из 2000 семян каждого сорта отобрали по 20, корешки которых были наименее угнетены в росте. Полученные устойчивые проростки высадили в грунт. С растений собрали плоды, из которых выделили семена. 55 Образцы семян с каждого растения проращивали: а) в присутствии воды, б) в присутствии 0,1раствора экстракта. Спустя 5 суток измерили длину корешков проростков, Образцы, у которых отношение б/а быпо наибольшим, послужили основой след- ющего цикла отбора, По 2000 семян тех ру;,- тений, семена которых были наиболее устойчивыми отношение б/а наибольшим), проращивэли в присутствии 0,1 ф водного раствора экстракта А.эсап ВКМ РД,По 2, наиболее устойчивых праростков вы- садили в грунт. Затем сравнили поражение отобранных растений альтернариозом по сравнению с растениями тех же сортов, нЕ прошедшими отбор табл, 1).П р и м е р 2, Штамм ВКМ Р - 3236 Д выращивали в поверхностной культуре на среде Чапека, В колбе Зрленмейера емкостью 300 мл наливали па 150 мл среды, автоклавирсвали 40 мин при 0,5 - 0,6 атм.избыточного давления, затем после охлаждения инскулировали мецилиальными дисками диаметром 10 мм. Диски вырезали у краев семи-десятисуточных колоний, выросших на агаризованной среде Чапека-Докса. Колбы с грибом оставили в покое при комнатных условиях на 70 суток, По оконча-нии инкубации отфильтровали культуральную жидкость и экстрагировали равным объемом хлороформа. После стгонки хлороформа на ротсрном испарителе получили экстракт штамма ВКМ Е - 3236 Д, который использовали в селекции томатов на устойчивость к альтернариозу.Цветки растений томатов сортов Молдавский ранний, Ранний - 83 и Ликурич кастрировали накануне раскрывания. На рыльца пестиков наносили каплю водного раствора экстракта А,зоап ВКМ Г - 3236 Д в концентрации 0,1. Заем нанОсили пыльцу томатов тех же сортов, После опыления цветки закрывали ватными изоляторами. Из созревших плодов выделяли семена и подсчитывали их количества: а) в плодах, полученных при искусственном опылении с использованием экстракта штамма ВКМ Р - 3236 Д; б) в плодах, полученных при искусственном опылении, где вместо экстракта на рыльца пестиков наносили каплю воды; в) в плодах, где опыление происходило естесственным путем, Из семян, собранных с. растений, для которых отношение а/б было наибольшим и приближенным к отношению а/б, вырастили томаты следующего поколения, Их цветки кастрировали и повторили перечисленные действия. В следующем поколении растений провели сравнение поражаемости альтернариозом тех томатов, которые подверглись пыльцевой селекции с применением штамма ВКМ Р - 3236 Д, и сортообразцов исходных форм. Результаты сравнения приведены втабл, 2.1818041 8 формула изобретения Таблица 1 Полевая оценка поражаемости растений томатов альтернариозом ( в баллах по пяти бальной шкале)П р и м е ч а н и е. Различие поражаемости не прошедших отбор и отобранных растенийждого сорта достоверны также при проверке по критерию Стьюдента (т = 0,05). енка поражае лица томатов альтернариозоой шкале) лев и растен в баллах по пяти ба поражаемости не прошедших пыльцевую селекцию и го сорта достоверны также и при проверке по критерию и е. Разл астений к отселектированны Стюдента (т = 0,05) Составитель О,ДараковТехред М.Моргентал Корректор О,Гу дактор 3 1910ВНИИПИ Тираж Подписноеарственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СС 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 ственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Из данных, представленных в табл. 1 и2, видно, что использование заявляемогоштамма позволяет снизить поражаемостьрастений томатов альтернариозом и, такимобразом, получить более устойчивые к заболеванию растения. Штамм гриба Атегпаг 1 а зо ап вогаоег ВКМ Е - 3236 Д, используемый для селекции томатов на устойчивость к альтернариозу,