Способ определения бензилатов в растворе

Номер патента: 1753416

Авторы: Балцере, Гринберг, Ефимцева, Кострова, Никольская

ZIP архив

Текст

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИРЕСПУБЛИК 51)5 6 01 К 33/4 тения гидроен илаой из 5, взятвиии" егистЕ.Б,Нистроваионометтет 1986 и втое этилатаму граилато 1 со ко.1 ил. быть реи и анаГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ 21) 4834274/14(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕНЗИЛАТОВ В РАСТВОРЕ(57) Использование; способ можетализован в медицине, фармакологи УИзобретение относится к медицине, вчастности к ферментным методам анализа ик фотоколориметрическому определениюбензилатов в растворе,Специфичностью по отношению к бензилат-иону обладает бензилатный ионселективный электрод. Электрод имеетлинейную электродну;о функцию в пределахконцентрации бензилата 10 - 10 моль/л.-1 -4Способ определения бензилата ионселективным электродом выбран в качестве прототипа 1).Метод достаточно простой, заключает-ся в измерении потенциала электрода в присутствии исследуемого бензилата при рН6-10 с последующим нахождением концент-рации по градуировочному графику,Известный метод имеет следующиенедостатки: недостаточно высокая избирательность-электрод обладает чувствительностью к ионам других оксикислот литической химии. Сущность изобр заключается в определении скорости лиза 5 105-2 104 Мраствораиндоф цетата "быстрой" карбоксилэстераз печени северного оленя при рН 8,0-8 той в концентрации 5 Е/мл в присутс в отсутствие исследуемого раствора, р рируют скорость гидролиза в первой рой пробах, рассчитывают отношени показателей и концентрацию бензи растворе находят по калибровочно фику, Предел обнаружения бенз 2 10 моль/л. Способ обладает вь чувствительностью и специфичностью(салициловой, молочной); низкий предел обнаружения 10 -10 моль/л; определению мешают О, КОэ, ЯО 4, НР 04, Н 2 РО 4 и др,Цель изобретения - повышение чувствительности и специфичности способа.Поставленная цель достигается тем, что исследуемый образец растворяют в воде и опре 4 деляют скорость гидролиэа 5 10 - 2 10 М раствора индофенилацетата (ИФА) "быстрой" карбоксилэстеразой из печени северного оленя при рН 8,0-8,5 в присутствии и в отсутствие исследуемого раствора и концентрацию бензилата в растворе находят по градуировочному графику,Таким образом, предел обнаружения повышается до 2 10 моль/л. Метод является специфичным по отношению к бензилатам, Определению не мешают присутствие другихионов: СГ, МОз, ЗО 42, НРО 42, НРО 4. а также эфиров бензиловой кислоты или других производных бенэиловой кислоты.Оказалось, что бензилзт-ион являетсясильным, специфическим ингибитором поОтношению к фермету карбоксилэстеразе.Даже присутствие микооколичеств бензилата в растворе заметно снижает активнОсть карбоксилэстеразы, следОВзтельнои скорость ферментативного гидролизаиндофенилацетэтасубстрата карбоксилэстеразы этим ферментом, Сн(лжениескорости ферментативной реакции завислт от присутствующего количествабензилата, Соотношени 8 скоростей феоментативюго гидролиза ИФА карбоксилзстеразой в присутствии и отсутствиибензилага ложно использовать для определения содержания бензилятя В 1 застворе,НЯ ч( р 88 г(рив(:.дсн Ррадурову 1 ыйграфик,П р и м 8 р 1, Определяют скоростьгид 1(олиза 1 у(ФА бьстрой каобоксилэсте"разой в Воде зя 81 ле ч);Прлготе(вливают реакцио 1 у 0 сРлесь Вобщем обьеме 5 мл из 1 мл раствора ИФА сконцентрацией 5 10моль/л, 1,9 мл фосфат, го буфера с р,.1 8,0, 2 мл НО. Добавляют 0.,1 мл раствора "быстрои"карбоксилэстеразы с концентрацией,ПрИМЕр 5 Е/МЛ,Проводят ферментативнуо реакциогидролиза соглзс.о известной методике,О пределяю г активно; 1 ь кярбо(сил зс ерязыПО (ЭРЯСТЯИЮ ОПТИЕСКОЙ ПЛОТНОСТИ РЯСтво-а при 625 нм за счет образования продукта гл уролиза 14 ФА13 йден (уО:. ктл Вн ость перссчиты Вз отна едлницу Вреьони РИин,) и относят к 1 мгбелка, что является скоростьо ферментатлвРОЙ пеэкции, Получают зна е 1 ле ч = 1,1,Определяют скорость гидролиза ИФАбыстрои карбокс 1 Рэстеразпи В 31 ализируемом растворе, содержащем бенз(ллат зняЧОНИ 8 Ч,),Прлготявливаот реак 1 Онную смесьиз 1 Р;(л ра твора И ФА с концентрацией5 10. моль/л, 1,9 мл фосфатного буферас рН 8,0 и 2 мл анализируемого раствора Оензилата калия с концентрацией1 10 мольу л, Дооавляют 0,1 мл раствооабыстрой карбоксилзстф".)Язы с такОй ж 8 конЦЕ-ТРЗЦИей КЯК В Реакц(ЛИ ОПР 8 ДЕЛЕНИЯ ЗНЗчения ч, т.е, 5 Е/Мл,Огределяютсксрость гидролиза согласно методика,Нахоу 1 йт знзчРние ч 1 . 0 88Получают Соотно(8 ие ч/ч 1 равное1,25,По градуировочному графику находцт ( Одержание б(ензлу(ата равное1 10 моль л П р и м е р 2. Определяот скоростьгидролиза ИФА "быстрой" карбоксилзстеразой в воде значение ч),Приготавливаот реакционнуо смесь в5 об цем обьеме 5 Рлл, состоя щуо из 1 мл раствора ИФА с концентрацией 2 10 моль/л,1 9 мл фосфатного буфера с рН 8,5; 2 мл Н 20и 0,1 мл раствора карбоксилзстеразы, Опредегяют скорость гидролиза ч равнуо 2,00,10 О п редел гпот скорость гидролиза И ФАкарбоксллэстеуазой в Янализируемолл растворе, содержащем бензилат,Приготавливают реакционную смесьиз 1 лл раствора ИФА с концентрацией15 2 10 4 моль/л, 1,9 мл фосфатного буфера с рН 8,5; 2 ил анализируемого раствора бензилата калия с коцентрацией3,5 10 .оль/л, Дооявля(от 0,1 мл растворакярбоксил яств разы, О пределя ют скорость20 гидролиза ИФА, согласно методике. Находят значение ч( равное 0,47,Получают соотношение ч/ч равное4,25. По градуи ро воч ному графику находят содержание бензилата, равное25 3,5 10 В моль/л.П р и м е р 3, Определяют скоростьгидролиза ИФА ."быстрой" карбоксилзстеОазой В воде,Приготавливают реакционнуо с(лесь,30 состоящуо из 1 мл раствора ИФА с концентрзциел 8 10 моль/л, 1,9 мл фосфатногобуфсра.с рН 8,3; 2 мл Н 20 и 0,1 мл растворакароосилэстерззы, Находят скооость гидролиза ИФА, равнуьо 1,95.35 Огроделяот скорость гидролиза ИФАкарбоксилэстеразой в анализируемом растворе, содержащем бензллат.Приготявливаот реакционную смесьиз 1 мл раствора ИФА с концентрацией40 810 у 5 моль/л, 1,9 мл фосфатного буфера срН 8,3, 2 мг анализируемого раствора бензилата с концентрацией 2,5 10моль/л,Добавляют 0,1 мл раствора карооксигзстеразы45 Определяют сорость гидролиза ИФАсогласно методике, Находят скорость гидролиза ч = 0,62, Получэ:от соотногвен(ле ч/чравное 3,15 и находят содеркаие бензилата, равное 2,5 10 моль,л,50 П р и м е р 4, Приготявливаот реакционнуО смесь для определения скорости гидролиза ИФА и воде: 1 мл раствора ИФА сконцентрацией 4 10 моль/л, 1,9 мл фос фапого буфера с рН 7,5; 2 мл Н 20 и 0.,1 мл5 раствора каобоксилэстеразы, Находят скорость .у гидролиза ИФА, равную 1,0,Определяют скорость гидролиза ИФАкарбоксилэстеразы в анализируемом растворе, содержащем бензилат.Приготавливают реакционную смесь из 51 мл раствора ИФА с концентрацией 4 10моль/л, 1,9 мл фосфатного буфера с рН 7,5;2 мл анализируемого раствора бензилата сконцентрацией 2,5 10 моль/л. Добавляют 5-в0,1 мл раствора каобоксилэстеразы. Определяют скорость гидролиза ИФА согласно методике. Находят скоростьгидролиза ч = 0,981. Получают соотношение ч/ч 1, равное 1,25, . 10Соответствующее содержание бензилата равное 1 10 моль/л. Видимо, концентрация субстрата в данных условиях реакциине достаточная. Ферментативная реакцияпроходит медленно, что вносит ошибку в 15определении содержания бензилата.П р и м е р 5. Приготавливают реакционную смесь для определения скорости Гидролиза ИФА в воде,1 мл раствора ИФА с концентрацией 203 10 моль/л, 1,9 мл фосфатного буфера срН 8;7; 2 мл Н 20 и 0,1 мл раствора карбоксилэстеразы, Находят скорость ч гидролизаИФА, равную 2,1.Определяют скорость гидролиза.ИФА 25карбоксилэстеразой в анализируемом растворе, содержащем бензилат,Приготавливают реакционную смесьиз 1. мл раствора И ФА с концентрацией3 10 моль/л, 1,9 мл фосфатного буфера с 30рН 8,7; 2 мл анализируемого раствора бен-,зилата.с концентрацией 2,5 10 моль/л.Добавляют 0,1 мл раствора карбоксилэстеразы. Определяют скорость ч гидролиза35ИФА равную О,б.Получают соотношение ч/ч равное 3,5.Находят содержание бензилата в растворе равное 2,8 10 в моль/л.При данной концентрации субстрата ир Н 8,5 ферме нтативна я реакция и роходит 40 спонтанно, что вносит ошибку в определении содержания бензилата.Для подтверждения специфичности метода по отношению к бензилатам, приводим дополнительный примео: . 45П р и м. е р б, Определяют скорость гидролиза ИФА "быстрой" карбоксилэстеразой в воде (значение ч);Приготавливают реакционную смесь в общем обьеме 5 мл из 1 мл раствора ИФА с 50 концентрацией 5 10 моль/л, 1,9 мл фос- я фатного буфера с рН 8,0; 2 мл Н 20, Добавляют 0,1 мл раствора "быстрой" карбоксилзстеразы с концентрацией, например, 5 Е/мл,Проводят ферментативную реакцию гидролиза.Определяют активность карбоксилэстеразы по нарастанию оптической плотности раствора при 625 нм за счет образования продукта гидролиза ИФА,Найденную активность пересчитывают на единицу времени (мин.) и относят к 1 мг белка, что является скоростью ферментативной реакции,Получают значение ч = 1,1,Опоеделяют скорость гидролиза ИФА быстрой карбоксилэстеразой в анализируемом растворе, содержащем бензилат (значение ч);Приготавливают реакционную смесь из 1 мл раствора ИФА с концентрацией 5 10 моль/л, 1,9 мл фосфатного буфера с рН 8,0 и 2 мл анализируемого раствора метилового эфира бензиловой кислоты с концентрацйей 1 ".0 моль/л, Добавля 8ют 0,1 мл раствора "быстрой" карбоксилэстеразы с такой же концентрацией как в реакции определения значения ч, т,е. 5 Е/мл,Определяют скорость гидролиза согласно методике,Находят значение ч = 1,1.Получение одинаковых значений ч и ч равных 1,1, означает что ингибирование фермента данным эфиром не произошло, Следовательно, существует высокая специфичность быстрой КЭС только к бензилату, хотя по химической структуре данное соединение аналогично бензилату.П р и м е р 7, Определение неизвестного количества остаточного бензилата в промышленно выпускаемом препарате мета ци не.Анализ проводят аналогично примеру 2, Найденное значение ч = 2,0,Приготавливают реакционную смесь из 1 мл раствора ИФА с концентрацией 210 моль/л, 1,9 мл фосфатного буфера с оН 43,5 и,2 мл водного раствора метацина, содержащего 0,1 мл препарата.Далее добавляют ИФА согласно методике. Найденное значение ч = 0,47. Получают соотношение ч./чь равное 4,25, Найденное по калибровочной кривой содержание бензилата в растворе метацина равно 3,5 10 моль/л,Предлагаемый способ обеспечивает обнаружение 2 10 моль/л бензилатов, не вывляемых классическими методами.Использование предложенного способа обеспечивает более точный контроль и оценку содержания бензилатов, в том числе в биологически активных соединениях. Формула изобретения Способ определения бензилатов в растворе путем их исследования с последую4 .1(, нсль/л оставитель Д,Балце ехред МЯоргенталКорректор О.Кравцо Редактор Н,Химчук Заказ 2766 Тираж Подписное ВНИИПИ Государствейного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ С 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 роизводственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 10 щим нахождением концентрации бензилата по калибровочному графику, о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности и специфичности способа, проводят ферментативнрю реакцию гидролиза 5 10 . - 2 10 . М раствора индолфенилацЕтма карбоксилэстеразай из печени северыого оленя, взятой в концентрации 5 Е/мл, рН 8,0-8,3, гидролиз ведут в присутствии и в отсутствие исследуемого раствора бензилата, регистрируют его скорость в первой и второй пробах, рассчи тывают соотношение полученных показателей с последующим нахождением концентрации бензилата по калибровочному графику.

Смотреть

Заявка

4834274, 01.06.1990

НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННОЕ ОБЪЕДИНЕНИЕ "БИОЛАР", ЛАТВИЙСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

БАЛЦЕРЕ ДАЦЕ ЮЛЬЕВНА, ГРИНБЕРГ БЕАТА АНДРЕЕВНА, НИКОЛЬСКАЯ ЕЛЕНА БОРИСОВНА, ЕФИМЦЕВА ЭЛЕОНОРА АФРИКАНОВНА, КОСТРОВА ВАЛЕНТИНА МИХАЙЛОВНА

МПК / Метки

МПК: G01N 33/48

Метки: бензилатов, растворе

Опубликовано: 07.08.1992

Код ссылки

<a href="https://patents.su/4-1753416-sposob-opredeleniya-benzilatov-v-rastvore.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентов СССР">Способ определения бензилатов в растворе</a>

Похожие патенты