Способ диагностики коклюша

3173227 ве отрицательного и положительного контролей. Для приготовления двух первых препаратов (опытного и отрицательного контрольного) на два обезжиренных предметыи стекла наносят по одной капле исследуемого субстрата пастеровской пипеткой из пробирки с тампоном. Для приготовления мазка, используемого в качестве положитель-. ного контроля, на обезжиренное предметное стекло наносят каплю физиологического раствора и петлей наносят культуру В,регцззз. После подсушивания на воздухе все три препарата фиксируют в течение 20 мин в этиловом спирте, охлажденном в морозильной камере холодильника. Мазки на высохших стеклах обводятся с обратной стороны препарата карандашом по стеклу 20 для облегчения последующего просмотра под микроскопом. Затем препараты по- мещаются во влажную камеру и на них наслаивают кроличью коклюшную гипериммунную агглютинируюцую сыворотку с 25 титром не ниже 1:25600 и разведении 1:100, отцентрифугированную при 3000 об/мин в течение 10 мин, Все разведения сывороток производят в забуференном физиологическом растворе 30 (состав: БаС 1 8,65. г; ЯаНРО 1,92 г; КНРО 0,44 г; дистиллированной воды 1000 мл; рН = 7,2-7,4); автоклавируют 30 мин при 0,5 атм. В качестве влажной камеры можно использовать стерилизатор с небольшим количеством телового Физиологического раствора на дне, помещая стекла на перевернутую вверх дном сетку стерилизатора. С . закрытой крышкой стерилизатор ставят 40 в термостат при 37 фС на 15 мин. Затем препараты тщательно промываются поочередно в двух стаканах с буферным физиологическим раствором по 5 мин с помощью пинцета и подсушиваются на воздухе в вертикальном положении на Фильтровальной бумаге. На два препарата (опытый и положительньй контроль) наливают люминесцирующую сыворотку против глобулинов,кролика в 50 разведении 1:10, а на препарат, используемый в качестве отрицательного контроля, наслаивают люминесцирующую сыворотку против глобулинов лошади в разведении 1:10 производства того же института. (Люминесцирующие свороткй в рабочем разведении необходимо центрифугировать при 3000 об/мин в тече-ние 10 мш). Далее все препараты вы 8 4держивают во влажной камере при 37 С в течение 15 мин, после чего аккуратно промывают дважды в свежем буферном физиологическом растворе по 5 мин с помоцью пинцета, сушат,на воздухе в вертикальном положении и просматривают под люминесцентным микроскопом. Микроскопию проводят в подающем свете с использованием фильтров ФС 1-2, БС 8-2, СЗС 7-2, Запирающий фильтр Т-Н, объектив 90 х, окуляр 10 х, сила тока при микроскопии 4,5-5 А. Для микроскопии применяется нефлюоресцирующее иммерсионное масло П = 1,516, Для оценки интенсивности свечения используется четырехкрестовая система;очень яркая лнминесценция по периферии клетки,яркая люминесценция периферии клетки,или + слабое свечения периферии клетки; - люминесценция клеток отсутствует. Положительным результатом считается люминесценция клеток, оцениваемая на + + и . Такое свечение должно быть в препарате, используемом в качестве положительного контроля. В препарате, используемом в качестве отрицательного контроля, специфическое свечение не должно наблюдаться.Опытный препарат необходимо просмотреть не менее, чем в 50 полях зрения и при наличии 3-4 и более специфически светящихся клеток, результат считать положительным. При обнаружении аналогично светящихся микробных клетокв препарате, используемомв качестве отрицательного контроля, результат считается отрицательным.Остальные контроли необходимо ставить при использовании новых серий гипериммунной и люминесцирующей сывороток.Исследования показали возможность использования в качестве коклюшной гипериммунной агглютинирующей сыворотки комерческой коклюшной агглютинирующей сыворотки, полученной пу- . темиммунизации ослов при наличии Ф коммерческой люьинесцирующей сыворот" ки против глобулинов осла (использовалась экспериментальная серия ро" изводства того же института). Дпя ф постановки непрямого иммунофлюоресцентного метода при диагностике коклюша.Непрямой иммунофлюоресцентный метод также может быть использован для3идентификации вццеленных культур,5173 что особенно важно при исследовании атипичных штампов.При разработке предлагаемого мето-,. да проводили сравнительные исследования по отбору жидкости, применяемой для смачивания тампонов при заборе материала с задней стенки глотки. Исследовались следующие жидкости: физиологический раствор (0,857 раствор хлористого натрия), физиологический раствор, забуренный фосфатами, смесь Кузнецова, применяемая для увлажнения тампонов при обследовании на коклюш, содержащая кроме физиологического раствора активированный уголь, агар- агар и Фосфатный буфер.Было показано, что использование для смачивания тампона физиологического раствора одновременно с обтряхиванием тампона стеклянными бусами диаметром 6,0 мм обеспечивает получение сверхсуммарного результата.Известный метод смачивания тампонов питательной средой не использовался. Питательная среда, например с сыворотка крови, используется при бактериологическом исследовании для смачивания .тампона в качестве транспортной среды, рассчитанной на сохранение жизнеспособности микробов и , подращивание их в процессе транспортировки в течение нескольких часов. При исследовании НИФ-методом смачивание тампона физиологическим раствором применялось лишь для улучшения его адсорбционных свойств, а не как питательная среда для микробов, так как неважно, живой или погибший микроорганизм будет в дальнейшем реагировать с иммунной сывороткой.Проводилось также сравнительное исследование по подбору оптимального количества дистиллированной воды, в которой встряхивался тампон с бусами. Расчет добавляемой дистиллированной воды делался не из объема, необходимого для смачивания ватного тампона (так как тампон, предварительно увлажненный физиологическим раствором перед забором материала, больше жидкости не впитывал), а определялся минимальной величиной, которая бы обеспечивала наибольшую концентрацию микробов в единице объема и почти полностью использовалась при приготовлении препаратов. Исследовались три объема: 05 мм, 0,25 мм и О, 15 мл. Так как для.приготовления препаратов,2278использовались две крупные капли, приисследовании первых двух объемов большая часть взвеси оставалась неиспользованной. Это понижало шансы на обнаружение возбудителя коклюша. К томуже и концентрация микробов в этих,вэвесях была меньше. При обтряхиванинтампона в 0,15 мл дистиллированной10 воды весь объем исследуемой жидкостиполностью использовался для приготовления препарата.Для повышения чувствительности метода большое значение имеет способ 15 обтряхивания тампона, содержащего исследуемый материал. Пооволились исследования по использованию для обтряхивания тампона в О, 15 мл дистиллированной воды мелких стеклянных бус 20 диаметром 3,0 мм, а также крупныхстеклянных бус с диаметром 6,0 мм,которые, обычно применяются только длядефибринирования крови, а для обтряхивания тампонов никем не применялись,Для контроля исследовалось обтряхивание тампона без бус. Исследовалисьвзвеси коклюшных бактерий в концентрациях 107, 106, 10 и 10 ф микробныхклеток в 1 мл.30 Было поКазано, что использованиемелких стеклянньм бус при встряхивании не обеспечивает эффекта выколачивания микробов, так как масса бусинок, а следовательно, и их ударная З 5 сила очень мала. Тогда как стеклянныебусы с диаметром 6,0 мм обеспечиваютболее высокую концентрацию микробов висследуемой жидкости и потому существенно повышают чувствительность и 40 точность метода.Предлагаемый способ превосходитизвестный но чувствительности за счет.использования непрямой реакции иммунофлюоресценции вместо прямой, при менения отдельного тампона, Ъе ис- г,пользованного предварительно для производства бактериологического посева,увлажнения тампона перед забором материала, что улучшает условия забора, 50 сохранность материала при транспортировке в лабораторию, использования;при встряхивании крупных стеклянныхбус с диаметром 6,0 мм, значительноувеличивающих концентрацию микробов 55 в исследуемом субстрате по сравнениюс известным способом и унифирует условия обогащения исследуемого субстрата при встряхивании, так как прили-ваемая дистиллированная вода не впи-:1732278 дывается увлажненным тампоном. Предлагаемый способ превосходит известный и по специфичности, поскольку он уменьшает количество ложноположительных реакций за счет выявления неспецифического свечения в контрольных . препаратах.П р и.м е р 1, Непрямым иммунофлюоресцентным методом обследовано 135 детей, из них 48 с подозрением на коклюш, 39 - контактировавших с больными коклюшем, 4 ребенка с подтвержденным диагнозом ОРЗ коккавой этиологии и 44 здоровых ребенка.5Для выявления чувствительности НИФ-метода все дети с подозрением на коклюш и контактировавшие с больными коклюшем подвергались также бактериологическому и серологическому иссле дованиям. НИФ-метод был положителен у 54 детей из 87. Все случаи положительных результатов при НИФ исследовании подтверждены серологическим методом, а 12 - еще и бактериологи ческим.Здоровые дети и больные ОРЗ помимо НИФ метода также исследовались бактериологическим методом. Результаты исследований у всех детей были отрицательными.Таким образом, НИФ метод чувствительнее бактериологического. Кроме того, он обладает рядом преимуществ но сравнению с серологическим мето 35 дом: позволяет избежать негативных моментов, связанных с двукратным за-./ бором крови для реакции агглютинации, дает возможность выявления коклюшного антигена в течение всего срока забо3 левания, начиная с первых дней, результат НИФ может. быть получен в течение нескольких часов. Доказано, что исследуемые штаммы В.регцззз даютяркое специфическое свечение в опытных препаратах и не дают свечения или светятся на + в контрольных препаратах. Специфическое (иногда неспецифическое, но яркое) свечение наи нав опытных препаратах дают также 40% исследованных штаммов Б.апгецз,однако все они светятся и в контрольных препаратах на ,или , т.е легко отличаются от В,регЬьззхз, штаммы которого в контрольных препаратах либо не дают свечения, либо светятся на +. Кроме того, светящиеся стафилококки легко отличить от коклюшных палочекЮпо морфологии и по неспецифическому (всей поверхностью микробной клетки) свечению. Формула и э о б р е т е н и я Способ диагностики коклюша путем забора исследуемого материала из зева обследуемого носоглоточным тампоном, помещения его в дистиллированную воду со стеклянными бусами и встряхивания. с последующим исследованием приготовленных проб жидкости в реакции иммунофлюоресценции, о т л и - ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности и специ фичности способа; перед забором материала тампон увлажняют в 0,852-ном растворе хлорида натрия, встряхивание тампона проводят в 0,15 мл дистиллированной.воды в присутствии 3-4 стек - лянных бус диаметром 6 мм, а исследование проб жидкости осуществляют в непрямой реакции иммунофлуоресценции.,сставитель П.БокарцевРедактор В.Бугренкова Техред А.Кравчук Корректор С,Иекмар Заказ 1580 Тираж Р ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб д, 45 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101