Раствор для извлечения эмбрионов

(57) Изобретение относится к сельскому хо-, зяйству, в частности к ветеринарии, трансплантации эмбрионов, Целью изобретения является повышение технологичности приготовления раствора, возможность осуществления стерилизации любым способом, увеличение сроков хранения. Раствор для извлечения эмбрионов содержит в 1 л бидистиллированной воды хлористый натрий, натрий фосфорнокислый двузамещенный, калий кислый фосфорнокислый однозамещенный. Ингредиенты .в растворе находятся в следующем соотношении, г; хлористый натрий 8,2 - 8,7; натрий фосфорнокислый двузамещенный 2, 17 - 2,8; калий кйслый . фосфорнокислый однозамещенный 0,2 - 0,4. 4 табл,и 120 ится к области сель-.ости к ветеринарии,нов., предназначенные ти, для а самок , Хэма- биолоами, В апаше слоты,ми, в частно из организм створы Игла различнымикими добав рописи Могд дят аминок 50 70 ислота 600;1 6,625 ;625 646 6,625 .6,01 0,6 ОДЦ,. 2 лота-.Н 20 11 5 20 10 ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМРИ ГКНТ СССР ПИСАНИЕ ИЗОБРВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Научно-исследовательский институт жвотноводства Лесостепи и Полесья УСС(56) Адамс Р. Методы культуры клеток дбиохимиков. - М. 1983, с.231 и 232, табл,Инструкция по трансплантации эмбонов сельскохозяйственных животных. -1984, с.39 - 41,(54) РАСТВОР ДЛЯ ИЗВЛЕЧЕНИЯ ЗМБРИОНОВ Изобретение относского хозяйства, в частнтрансплантации эмбриоИзвестны растворыдля работы с эмбрионаизвлечения эмбрионовмлекопитающих. Зти о10, Средаи другие сгическими и синтетичесостав Средыв и1958, к примеру, вхомг/л:1,15 Рибофлавин 0;01Тиамин НС 1 0,0.1Витамин А (ацетат) 0,14Поскольку эти растворы предназначеныв большей степени для культивированиямикроорганизмов, вирусов, культуры тканей и при контакте с внешней средой теряют свое первоначальное биологическоекачество, в связи с этим применение их дляизвлечения эмбрионов иэ организма самокне получило широкого распространения впрактике, кроме того, они очень дорогостояющие,Наиболее широкое распространениедля извлечения эмбрионов получил растворДюлбекко следующего состава:Натрий хлористый, 8,0Калий хлористый0,200Натрий фосфат дву. замещенный безводныйКалий фосфат однозамещенный 0,20Магний хлористый 6-водный 0,10Кальций хлористый безводный 0,10Натрий пирувиат 0,036Глюкоза 1,0Вода бидистиллированная До 1000,0Непосредственно перед применениемв раствор дополнительно вносят 20 мл фетальной сыворотки и антибиотики (пенициллинкалиевая соль 0,03 мг/мл истрептомицин 0,05 мг/мл). Концентрацияводородных ионов (р Н) раствора колеблется7,05-7,4 и осмотическое давление 290-300мосмоль.Компоненты растворяют в указаннойпоследовательности и стерилизуют путемфильтрации под давлением через бактериальные фильтры типа Зейца или Милипоровые фильтры.При изготовлении раствора Дюлбеккообразуются труднорастворимые осадки углекислых и фосфорнокислых солей кальцияи магния. В связи с этим соли кальция имагния растворяют отдельно и в виде раствора добавляют к основной части его,включающей остальные компоненты. Необходимость поэтапного изготовления раствора и его многокомпонентность,изменение качества при стерилизации, автоклавировании ионизирующими лучами, быстрое размножение микроорганизмов приконтакте с внешней средой, при котором онприобретает токсичность, все это усложняет его применение и повышает стоимость.Не обоснованно вносят в раствор дляполучения эмбрионов антибиотики и фе 40 50 55 йаС 8,2 - 8,7 МагНР 04 2,17 - 2,8КН 2 Р 04 0,2 - 0,4Для получения раствора приготовлены смеси ингредиентов, содержащие каждая в 1 л бидистиллированной воды различные соотношения (граничные и заграничные). Данные сведены в табл,1. Каждая смесь готовится отдельно и подвергается измерению физико-химических параметров и выживаемости эмбрионов при инкубации в этих растворах, Эффективность растворов оценивают по способности эмбрионов культивироваться 1 и Инго в предлагаемом растворе в течение 24 ч, в качестве контроля использован раствор Дюлбекко. Поскольку важным условием выживания является концентрация водородных ионов (рН) и осмомолярность, то в предлагаемом растворе эти показатели имеют оптимальные величины, необходимые для развития эмбрионов, а именно: 292 = 3,7 мосмоль и рН 7,1,Преимуществом предлагаемого раствора по сравнению с известным является твльную сыворотку, в этом нет ни биологической, ни экологической необходимости.Рабочей гипотезой для поиска болеепростого солевого раствора для изготовле ния эмбрионов, сохраняющего биологические качества эмбрионов и обладающего теми же физико-химическими параметрами, являлось следующее положение. эмбрион до определенной стадии обладает потенци альной возможностью развития (без внесения в раствор для извлечения дополнительных компонентов) и он этф свойство сохраняет в промывочной среде.Используемые солевые растворы для 15 извлечения эмбрионов, в том числе и предлагаемый раствор Дюлбекко, обогащаются из матки органическими и минеральными,также биологически активными вещества- ми, которые сохраняют биологические качЕ ства эмбрионов и обеспечиваетдальнейшее их развитие, Так же не обязательно и делать солевой раствор сильйе щелочной (более 7,0 - 7,1),для извлечения, эмбрионов, поскольку в самой маточной па-.25 лости среда щелочная.Целью изобретения является повышение технологичности приготовления раствора, снижение стоимости, возможность осуществления стерилизации любым изве.- 30 стным способом и увеличение сроков хранения раствора.В известном растворе, в состав которого входит на 1 л бидистиллированной воды йаС, йа 2 НР 04, КН 2 РО. все укаэанные инг редиенты берут в следующем соотношении;1713529 10 15 20 30 45 Таблица 1 Количество веществ на 1 л раствора, г Опыт Физико-химические показателиВыживаемость эмбрионов при инку- бироаании 1 п чЕго. в течение 24ч,Осмотическое давление,мрсмольБидистил- лированная вода Концентрация водородных ионов (рН), отн.ед,Натрий фосфорнокислый однозамфщенный0,1 1000,0 20 278+4,5 40 6,8 8,0 увеличение сроков хранения раствора, воэможность его стерилизации и приготовления, снижение затрат на его изготовление и снижение стоимости раствора более чем в 10 раз,Для подтверждения того, что предлагаемый раствор не уступает известному, поставлены опыты по выживаемости эмбрионов (табл,2), В табл.З приведены физические показатели растворов после использования.Из табл. 2 видно, что при культивированиии чего эмбрионов, полученных опытным раствором и известным раствором,разницы в их развитии и выживаемости не наблюдалось. А это касается концентрации водородных ионов (рН) и осмотического давления (табл.З), отклонения этих показателей от нормы в известном растворе больше. чем в предлагаемом.Удельная плотность известного и предлагаемого растворов одинаковы до и после использования этих растворов для извлечения эмбрионов,Учитывая, что змбрибны находятся"в те чение малого времени в промывочной жидкости при извлечении их из матки, а также тот факт, что в этот период жизни не велики физиологические потребности эмбриона в питательных веществах, а зти необходимые питательные вещества эмбрион для поддер. жания физиологической функции получает иэ промывочной жидкости матки, поскольку промыеочная жидкость из матки обогащается пролефератом железистого эпителия эндометрия, содержащим полный комплекс биоорганических веществ в достаточном . количестве, нет необходимости вносить в раствор дополнительно питательные вещества, В связи с этим главным является под держание физико-химических параметров раствора, а именно этого добиваются, используя предлагаемый раствор. Предлагаемый раствор позволяет испольэовать любой способ стерилизации, что невозможно осуюцествить в известном способе, Для подтверждвния преимущества предлагаемогораствора проведены опытные испытания растворов для изучения физико-химических свойств их после стерилизации ускоренны- ми электронами и автоклавированием. Данные сведены в табл,4.Из табл.4 видно, что при стерилизации известного раствора ускоренными электронами так же как и при кипячении наблюдается изменение цвета раствора, он приобретает желтую окраску. При этом входящие в состав известного раствора прототипа и глютаминовая кислота деполимеризуются и при этом изменяется и качественный состав. При этом концентрация водородных ионов известного раствора сдвигается в щелочную сторону, что отрицательно сказывается на выживаемости эм-. брионовДанные. вытекающие из табл.4, убежда. ют в том, что известный раствор, при воздействии на него факторов внешней среды, менее устойчив как по качественному составу, так и по физико-химическим параметрам, чем предлагаемый раствор. Ф ор мул а и зо бр ете н и я Раствор для извлечения эмбрионов, со,держащий бидистиллированную воду, хлористый натрий, натрий фосфорнокислый двузамещенный, калий кислый фосфорно- кислый однозамещенный, о т л и ч а ю.щ и й с я тем, что, с целью повышения технологичности приготовления раствора; возможности осуществления стерилизации любым способом, увеличения сроков хранения, он содержит ингредиенты в следующем соотношении, г 1 л бидистиллированной воды:Хлористый натрий 8,2 - 8,7 Натрий фосфорнокислый двузамещенный 2,17 - 2,8 Калий кислый фосфорнокислый однозамещенныи ,0,2 - 0,4Опыт Бидистил- лированная вода Осмотическое давление, мосмоль Натрий хлористыйПлотность среды Раствор Осйомолярность, мосмольпосле использования до использования после ис- до испольпользова- зованияния после ис- пользова- ния Левый рог Правый рог7,2+0,05 7,45+0,06 7,44+0,04 1,05 Дюльбекко(п =7) Предлагаемыйый и =8 300+8,2 310+8,5 294+4,4 296+4,5 7,1+0,55 7,16 Ю,ОЗ 7,2+0,08 1,05 Таблица 4 Бактериологическое иссле ование, Раствор Ивет Концентрация водоо ных ионов Ндо стери- после стелизации рилизации после сте илиза ии до стери- лизации до стери- лизации после сте- рилизации Ускоренными элект намиПредлагаемый (и 9) Отсутствие роста микробов (-) Отсутствие микробов Бесцветный7,1 Дюльбекко п 7) Рост микробов (+) То же Желтый Желтый 7,2 7,3 Составитель Е, КузнецоваТехред М.Моргентал Корректор О, Кундрик Редактор Н. Бобкова Заказ 641 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 ФКонцентрация водородныхионов ЬН), отн.ед. Выживаемость эм-брионов при инкуби роваНИИ 1 П ч 1 го в течение 24ч,