Способ отбора регуляторов роста растений цитокининовой и ауксиновой природы

.СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБ ЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Институт биологии Башкирского филиала АН СССР(56) Природные регуляторы роста растений, /Под ред. В.И. Кефели.-М., 1976.Ясппца, ВУ, ет а. Сутос 4 ппз. Оечеоргпепт о 1 а росепт аптадопзт; Ргос. Мат, Асад, Яс 1. ОБА 1971, 68, М 10. р. 2608 - 2610.(54) СПОСОБ ОТБОРА РЕГУЛЯТОРОВ РОСТА РАСТЕНИЙ ЦИТОКИНИНОВОЙ И АУКСИНОВОЙ ПРИРОДЫ(57) Изобретение относится к области физиологии растений и может быть использовано для поиска гормоноподобных регуляторов роста растений, использование которых является перспективным направлением химизации сельского хозяйства, Целью изобретения является упрощение и Изобретение относится к физиологии растений и может быть использовано для поиска гормоноподобных регуляторов роста растений, использование которых является перспективным направлением химизации сельского хозяйства.Целью изобретения является упрощение и увеличение производительности процесса отбора регуляторов роста цитохининовой и ауксиновой природы. П р и м е р 1. Получение конъюгата зеатина с белком и антизеатиновой сыворотки. Ы 1640654 А 1(н)5 601 й ЗЗ/53, А 01 й 6500 увеличение производительности процесса отбора регуляторов роста цетокининовой и ауксиновой природы. Способ заключается в контактировании испытуемых соединений со специфическими антителами к гормонам, полученным при иммунизации животных конъюгатами гормонов с белком. Антитела в данном случае рассматриваются как модели рецепторных сайтов гормонов, а их способность взаимодействовать с испытуемым соединением оценивают твердофазным иммуноферментным мет-дом (ТФ ИФА), Исследуемое вещество и раствор гормона (эталон) приводят в контакт с полученными антителами к гормону. Затем сравнивают способность тестируемых веществ и эталона ингибировать связывание антител к гормону, конъюгированному с белком и иммобилиэованному на полистироле. Количество антител, сорбированных на иммобилиэованном гормоне, оценивают с помощью твердофазного иммуноферментного анализа. 3 табл. 3,6 мг зеатинрибозида и 2,25 мг периодата калия растворяют в 1 мл дистиллированной воды и выдерживают при коь натной температуре, 20 мг белка растворяют в 1 мл дистиллированной воды и прибавляют па каплям к раствору зеатинрибоэида, рН доводят до 9,5 5-ным раствором соды. Добавляют 11,25 мг и смесь оставляют в холодильнике на 18 ч. Затем рН доводят муравьиной кислотой до 5,5 и оставляют смесь на 1 ч, после чего раствором аммиака доводят рН до 8,5.Антисыворотку к зеатину получают путем введения кроликами внутримышечноэ г" 1 МГ конъюГятя;эея"иня Оелком с 0,5 млпОлнОГО ЯДьюванта Фр 8 йнДЯ. 11 овтОрнь)8иммунизац 4 и с инГервялом В две неделипроводят в течение трех М 8 сяц 8 В тем жеКОЛИЧВСТВОМ ИММУНО 8 НЯ, СМРШЯННОГО С0,5 мл неполного Ядь 1 ОВнта дрейнда. Чер 83 неделю после последнВЙ иммунизациисооира)от,Я)кдого кроика ГО 20ви.итры Янтисывороток 1;1 ОООО по резуль ЯТЯМ, эЦВНКЯ 1)И) ОК 1 НИНОВОИ ЯКТИВ 11 ОС 4/тзРрдофяэным 414 муноферментньм 81 яизом (ТФКФА;.Исследуют ряд Ве)цеств ")язличной поироды, сред которых изв 8 стные цитокини"ноподобные регулятооы роста, КоньОлатзратинибоз 1;.)Я:)4 6-)81 зЯ) ИногуринрибозкДЯ,ГэАГ р)без 1 Г.;.4 с Овальбу 14 иномразводят в О,ОЬ Ь катрякароонат Ом Ьуфе 08 рН .:.,7 разливаОт В кя)кдуО лунку полиоТИРОЛОВОГ) Гэ)Ян 1)РТЯ 1 В).1 8)ИВэ Оттечение ,5 ч пэи д 1 ;.сРнсиби)изация),При атом происходит сорбцИя коньюгиРОванного ГОмрнЯ на ГОлистиРОловыйпланшет, После громывки лунок физ 4 олоГическим ОясГВОООм, сг)де)р)кяк)щ)4 м О,О 5,4Тви)аэ, РазЛг-)В)т В лУки сыВОРОтку,РЯЗВВГВННУЮ В "Т 4 )Г ОЯ "ТВООР "ОДР 1)ЧЯщи 4 ОЯ 4 Оеальбу,и 1 Я, В ряД.лунок ДобавЛя 1 О ПО 11 1,1:гЛ П 1" .)Оэ": г)лОл" В ра злим Ч Г.о О 4 ОЛЫ ЗР-Т,Ноибоэ 4) К)1)РТ 4 Ч яИ)14 НО)ПУОИН, Я 811";Н, ДГДООЗВЯТИН, ИзопеНТ 8 ниляденин, бензиляд 81141, кв-,ет 4 н, зеятин,ЯДенозин; АБК.ДОГчс и 14 ЫЙ диапазон концентрацийрегулятОрОВ рос та который исгОл ьзуют припоствновк 8, Ф)1 с"А, 1 - 10 мкГ/мл (конЦенТРЯ Чэ В"Н Кэ П 1 Я НРТЯИнкуЗяци)о Г 10)О)эят В ТВЧРНИ 8 1 4 ГОИ.)/ (., 111,)сле гром.Вк дооявляют Вия Ностические антитела поотив им 4 у 1 Олобул)и"НОВ КРОЛИКЯ У,оч 811 ЫР ПРог)К ИДЯ зОЙразведенные в фгк 4 ологическсч 1 ряс-воре,содер)кащ)ом О,1)5,э 1 ви)-Я-,0 и 1,5")э Овальб мина Ф 1 Д),)Ос) 1 ромьЯки Я 4 зиОлОГи18 С К И 14 р Я С 3 ) Г)О 1) С О Я""-" ДиЧ ОТаина(Ф "), Доаавля)ОТ субстрат для оценки активности пераксидязы (д,4 мг млортофенилендиами;Я В О,Об М аосфат)омбуфере ОН 5 8 э В ре")э. -, .я 1-8 ч"Го поя ВляетСяокраска, Через ЭО мин реакциО Оста)ЯвлиВЯ от доЯвлен)48 м О 1 мл 4 1 Яркой 1 илоть). Интенсив).Ость Окраскл измеря)от наспектрофотометре при 492 нм,11 ОГР"о".1 и-)1 унк"х В ко горы Ообавэ.ЛЯЮГ Веествф С "эРП 1 ИРЯОт С ПГ 11 ЛОЩРНИРМВ лунках кда копме .тте киче)О неДОбавЛЯ ЮТ З Я )ОРТ)ВВОНОВ ИНГ бИООВЯНИ 8связы Вяния (иммунОрРэкт 4 вность) Г 1 ринимяют сниженке ОптическОЙ плотности ООлее чем на 211 й ОО срзене 1 ию с контролем. Биотест на цитокининовую активость.Семена щирицы Ап)агаптцз саиоатоз 1, Оаскладывают на смоченную водой фильтровальную бумагу в чашки Петри и проращиваат в течение 72 ч в термостате в темноте при 24 С, Затем на рассеянном свету у проростков отделяют корешки и раскладывают на 10 шт. в чашки Петри диаметром 6 см на фильтровальную бумагу, смоченную 2 мл 1/75 М фосфатного буфера (рН 6,3), содергкащего 1 мг/мл тирозинг и вещества, исследуемого на цитокининовую активность (10 мг/л), Чашки инкубируют в темноге при 24 С, После 18 ч инкубации амарантин зкстрагируют 0,1 н НС (2 мл) Концентрацию амарантина определяют спектрофотометрически при 540 нм, Значение зкстинкции контроля (без исследуемо- ВещЕСтва) ПрИНИМаат За 1000)(э. УВЕЛИЧЕНИЕ зкстинкции раствора более,чем на 20 ф, по срявнени)о с контролем свидетельствует о цитокининовой активности исследуемого вещества,В табл, 1 пока.-.яно определение цитокиниковой активнос; и соединений.Как видно из табл. 1 цитокининоподобные вещества гроявляют иммунореактивность, а не обладающие цитокининовой активностью - нет, Таким образом, с помощьо ТФИФА можно отбирать вещества с гормоноподобной активностьЮ по их иммунореактивности в отношении специфической сыворотки к гормону (в данном г)римере к цитокинину зеатину).П р и м е р 2, Получение коньюгата индолилуксусной кислоты (ИУК) с белком,Растворяют 50 мг ИУК в 1 мл безводного диоксяня, добавляют 50 мг дициклогексил карбодимида, раствор встряхивают в течение ЗО мин при комнатной температуре, загем по каплям, перемешивая, добавляют к 10 мл 0,1 1 у 1 боратного буфера рН 8,5, содер)кащего 100 мг белка. Раствор оставляют на ночь В холодильнике, затем очищают от не- связавшегося ИУК диализом против 0,01 М боратного буфера рН 8,0, Антисыворотку получают так эке, как и для цитокининов,Оценка ауксиновой активности в ТФИФА.Условия проведения анализа те же, что и В примере 1, Отличие заключается лищь в том, что сенсибилизацию проводят коньюгатом ИУК с овальбумином и используют соответствующие антитела к ИУКСреди Веществ, которые подвергнуты анализу, в отличие от примера 1 взято больше ауксинподобных Веществ(известные ауксинподобные гербициды).Биотест на ауксиновую активность, 164065410 бации растворов 18 - 20 ч. Затем каждый 15 20 Как видно из табл. 2 ауксиноподобные 25 вещества реагируют с сывороткой к ИУК, а не обладающие ауксиновой активностью,Семена пшеницы Альбидум 43 замачивают в воде на 18 - 24 ч (при 24 С в термостате), затем раскладывают на фильтровальной бумаге, обильно смоченной водой. Кюветы сверху закрывают стеклами и помещают в термостат при 25 ОС на двое суток, Иэ трехдневных колеоптилей пшеницы выбирают колеоптили оптимальной длины 18 - 20 мм или 20 - 22 мм. Из отборных колеоптилей вырезается средняя часть. После удаления первого настоящего листа отрезки колеоптилей нанизывают по 10 шт. на тонкие стеклянные спицы и помещают в исследуемые растворы (1 0 мг/л). Период инкуотрезок колеоптилией в отдельности промеряют на миллиметровой бумаге и вычисляют среднюю величину отрезка, Увеличение длины отрезков более, чем на 20 по сравнению с контролем, свидетельствует об ауксиновой активности исследуемого вещества.В табл. 2 показано определение ауксиновой активности соединений. не реагируют, Иэ примера 2 видно, что по. иммунореактивности вещества (т,е. по способности его реагировать с сывороткой) можно отбирать ауксинподобные вещества.П р и м е р 3, Исследование способности веществ, отобранных с помощью антисыворотки к зеатину в ТФИФА, повышать выживаемость растений после подсушивания (тест на засухоустойчивость),Биологические испытания проводят на растених пшеницы сорта Симбирка (сред- неустойчивого к засухе), Семена в течение трех часов замачивают в растворе исследуемого вещества в концентрациях 0; 0,1; 1 и 10 мг/л. В качестве контроля берут вещества, не способные реагировать с антисывороткой к зеатину.Затем семена раскладывают на стекло, покрытое фильтровальной бумагой, и помещают в кюветы с дистиллированной водой, проращивают в термостате при 24 С. Через трое суток кюветы с растениями переносят на светоплощадку. На седьмые сутки после начала проращивания отбирают по 50 одинаковых проростков каждого варианта, отделяют зерновки и осторожно отрезают 30 35 40 45 50 корни с тем, чтобы не повредить меристематическую ткань. Затем проростки подсушивают в термостате при 24 С, пока потеря от исходной массы растений не составляет около 70, После этого растения раскладывают на фильтровальную бумагу, смоченную водопроводной водой, в кюветы, покрытые стеклом, выдерживают на свету в течение семи суток, К концу этого срока подсчитывают количество выживших растений (регенерировавших корневую систему).Результаты испытания веществ на зеатиновуюактивность представлены в табл, 3.Из табл. 3 видно, что эамачивание семян в растворах веществ, способных реагировать с антителами к зеатину, приводит к увеличению количества растений, выживших после подсушивания. Таким образом, вещества, отобранные с помощью антисыворотки к цитокинину зеатину (подобно другим веществам, обладающим цитокининовой активностью), повышают устойчивость растений к засухе. Результаты опыта свидетельствуют о том, что предлагаемый способ отбора позволяет обнаружить вещества, кбторые могут найти применение как регуляторы засухоустойчивости,Способ отличается надежностью, позволяет с достаточной легкостью анализировать одновременно десятки образцов, отличается небольшой трудоемкостью и длительностью, время проведения отбора сокращается с нескольких суток до половины рабочего дня,Формула изобретенияСпособ отбора регуляторов роста растений цитокининовой и ауксиновой природы, включающий контактирование испытуемых соединений с сайтами рецепции гормонов и последующую оценку по активности взаимодействия, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения и увеличения производительности процесса отбора, в качестве сайтов рецепции цитокининов и ауксинов ис. пользуют соответственно специфические антитела, полученные при иммунизации животных конъюгатами зеатина и индЬ- лилуксусной кислоты с белком, а оценку проводят твердофазным иммуноферментным методом.+ + Таблица 2 Иммунореактивность по реакции с сывооткой к ИУКИспытуемые вещества Индолилуксусная кислота2,4-Дихлорфеноксиуксусная кислота2-Метокси,6-дихлорбензойная кислота (банвел Д)3-Метил-хлорфеноксиуксуснвя кислота2-Метил-хлорфеноксимасляная кислотаАбсцизовая кислотаЗеатинАденин.Индолилмасляная кислотаИндолилкарбоновая кислотаФенилуксусная кислотаНа тил кс сная кислота Таблица 3 3 ватин3 ватин рибозид6-, БензиламинопуринИзопентениладенинКинетинАденинАденозинАнозинфосфатАденозинциклофосфатАденозиндифосфатАбсцизовая кислотаИндолилуксусная кислота Иммунареактивность Цитокининовая акпо реакции с сыво- тивность в биотестах роткой к зеатинрибо- зи