Способ размножения винограда in viтrо

3 СОВЕТСКИХЦИАЛИСТИЧЕСНИСПУБЛИК 12 Ю 5/00 ОБ ОМУ СВИДЕ 39учно-и сследоваарства и е ин и И.А.Ко8.8)и др. Тения соркультурьскохозяс.62 ЖЕНИЯ ВИ хнологияов вино лиронная ыйс5. Ю ГРАДА,ехно Изобретогии, в ч ие относится к биотности к способамтений,з ожени Цель ения - повышен е вы атек ч оем ве. П р на сордап ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(54) СПОСОБ РАЗМНО1 И ЧТТКО хода безвирусного посадо но о м риала и ускорение процесса .размн женияСпособ может быть использованв виноградарстве для ускоренного размножения и оздоровления перспективных сортов винограда, в исследованиях по фитопатологии и физиологии винограда, служит охране окружающей среды.Способ состоит в том, что осуществляют стерилизацию исходного материала, получение из него эксплантатов, введение их в культуру на среде Мурасиге-Скуга, содержащей цитокинин б-бензиламинопурин, микроразмножение и ускорение полученных побегов на твердой питательной среде с последующей высадкой в теплицу .для а тиро(57) Изобретение относится к биотехнологии и касается микроклональногоразмножения винограда. Целью изобре"тения является повышение входа безвирусного посадочного материала иускорение процесса размножения. Спо"соб состоит в том, что на модифицированную среду Мурасиге-Скуга высаживают меристемы, вычлененныеиз почек невызревших побегов. Затем получают побеги, обрабатывают их базальные концы Д -ИУК, укореняют, проводятмикрочеренкование, после чего адаптируют полученные растения .к условиямоткрытого грунта. 2 з.п.ф-лы. вания к нестерильным условиям, при этом в качестве исходного материала используют почки невызревших побегов,из которых вычленяют меристематичесую верхушку, а культуру 1 п чьего . осуществляют в три этапа с промежуточной обработкой базальных концов полученных побегов Д -индолилуксусной кислотой В-ИУК, при этом укоренение на втором этапе осуществляют на модифицированной. среде без ростовых веществ и с уменьшенным содержани макроэлементов.Кроме того, введение эксплантатов в культуру осуществляют на среде Мурасиге-Скуга при содержании б-бензил-. аминопурина 0,1-0,2 мг/л. При этом адаптацию полученных растений к не- стерильным условиям, проводят в пленочных теплицах на солнечном обогрер 1. Способ осуществляютвой селекции Агат донской.1601117 В конце сентября готовят невызр вшую часть основных и пасынковых п бегов. Побеги хранят во влажных о илках при 0 - 5 С в течение 2 мес.оВ начале декабря приступают к вычлен нию и культивированию эксплантатов, Перед посевом исходный материал стерилизуют. Заготовленные побеги нарезают на одноглазковые черенки, тщательно отмывают в теплой мыльной вое (40-50 С), для чего используютоетское мыло. Затем промывают водороводной и дистиллированного водой, г омещают в стеклянный бокс и на 40 с аливают 70 -ным этиловым спиртом,затем на 30 мин 10 -ным растворомипохлорида кальция, который отмыват в течение 10 мин в трех-четыреморциях дистиллированной автоклавиованной воды. После этого в стерильгом боксе под микроскопом МБСпри 5-кратном увеличении с помощью дис - изионных игл из почек вычленяют меистематические верхушки размером 0,17-0,25 мм (в зависимости от величины почек), состоящие из конуса нарастания и двух-трех листовых при. мордиев. Выделенные таким образом100 эксплантатов сорта Агат донской помещают на питальную срду Мураси,ге-Скуга следующего состава, мг/л (классическая пропись): ИН,гНО з 1650; КИО 1900; СаС 1 6 НО 440; МАМБО, х х 7 Н 20. 370; КНР 04 170; Н ВО з 6,2;Мп Б 04 4 Н 0 22, 3; СоСЕ 6 Н 0 О, 025; СггБО 4 5 НО 0,025; ЕпБОо 7 НО 8,6;, Ма 2 Мо 04 2 НтО 0,25; К 0,83; РеБО+ х х 7 Н О 27,8; НаЭЭТА 2 Н 0 37,3 идополнительно мезо-инозит 100; пи ридоксин 0,2; тиамин 0,2, никотино вая кислота 0,5; 6-бензиламинопурин(БАП) 0,15; сахароза З .; агар 7,5 г/л; рН среды перед автоклавированием 5,6.Пробирки с высаженными эксплантатами .помещают в культуральную комнату притемператур воздуха 25-27 С, фотопериоде 16 ч освещенности 5000 лк, относительной влажности воздуха 70- 75 .Через 5 нед из 100 высаженныхэксплантатов у 60 отмечается развитие. побегов до 8-10 мм длиной с четырьмя-пятью листочками. Так как образования корней у этих побегов не происходит, приступают к обработке базальных концов побегов раствором-ИУК. В боксе в асептических условиях побеги достают из пробирок и помещают базальными .концами на часовые стекла, в которые наливают раствор-ИУК в концентрации 100 мг/л.Через 20 ч побеги высаживают на моди 5фицированную среду Мурасиге-Скуга(второй состав), не содержащую ростовых веществ и с уменьшенным содержанием макроэлементов, мг/л: КМО950; ИН 110138; МяБОг 7 Н О 185; СаС 1 хх 2 Н 20 166, КНРО 468 мг/л. При этомГе -хелат,и микроэлементы оставили поМурасиге-Скугу, мезоинозит 50 мг/л,пиридоксин 0,2 мг/л; сахароза 10 г/л;рН 5,6-6,0.В течение месяца побеги укореняются и образуется 60 оздоровленных отвирусных заболеваний растений, Послеэтого приступают к их микроразмножению, Обеззараживанию растений способствует небольшой размер эксплантатов,выделяемых из почек невызренших побегов 0,17-0,25 мм, Оздоровленные растения размножают черенкованием: развившиеся растения разрезают оставляяна каждом отрезке один лист и почкув его пазухе. Этот микрочеренок сновапомещают в пробирку с модифицированной питательной средой второго состава, но в нее добавляют-ИУК в количестве 0,3 мг/л. Через 4 нед. укореняются 54 растения (процент укоренения составляет при этой концентрации-ИУК 90), через 2 нед приступают к микроразмножению растений. До1 июня проведены три пассажа. Коэффициент составляет 1:480.Перенос пробирочных укорененныхрастений в нестерильные условия осу 40ществляют, используя торфоперегнойные горшочки с субстратом из торфа,почвы и песка (1:1:1). С помощьюпинцетов растения извлекают из пробирок, пропаласкивают корни в дистил 45лированной воде, высаживают, поливаютводой и накрывают на 6 дн полиэтиленовой пленкой. Пленку приоткрывают нанесколько часов в день, а затем снимают. В дельнейшем растения регулярно поливают и подкармливают смесьюЧеснокова,После того как происходит адаптация растений, появляются один - двановых листа, растения высаживают впленочнье теплицы на солнечном обо 55 греве с неполностью контролируемымиусловиями выращивания: параметры темгпературы, влажности; освещенностискладывались и колебались в зависи 160111740 мости от метеоусловий. Экстремальныеусловия исключают путем регулярных проветриваний и поливов. Таким образом, данные условия приближены к5 естественным условиям среды произ растания полученного посадочного материала.П р и м е р 2. Способ осуществляют на сорте Восторг.10В начале октября готовят невызревшую часть основных и пасынковых побегов. Побеги хранят во влажных опилках при 0 - 5 С в течение 2 мес. Восередине декабря приступают к вычленению и культивированию эксплантатов,Стерилизацию исходного материала осуществляют, как в предыдущем случае. В стерильном боксе под микроскопом МБСвычленяют 100 верхушечных 20 меристем и помещают на среду Мурасиге-Скуга, которая отличается от среды, на которой культивируют Агат донской, содержанием БАП. 6-Бензиламинопурин вводят в среду в концентра ции О, 1 мг/л. Условия культивирования верхушечных меристем аналогичны условиям сорта Агат донской.Через 6 нед из 100 высаженных меристем 50 развивают побеги 8-10 мм длиной с тремя-четырьмя листочками, Базальные части этих побегов в асептических условиях обрабатывают раствором-ИУКв контентрации 101 мг/л и высаживают на среду Мурасиге-Скуга следующего состава, мг/л: КМО 955; 35 ИНИОз 140; М 8 Я 0,1 7 Н 0 187; СаС 12 х х 2 НО 167; КНРО 69; Ге - хелат, микроэлементы, сахароза и рН оставались без изменения, а мезоинозит 5 1 мг/л, пиридоксин 0,2 1 мг/л.В течение месяца 49 побегов укореняются и образуют оздоровленные растения. Через 2 нед приступают к их размножению путем микрочеренкования, В дальнейшем технология размножения 45 идентична для всех сортов, за исключением -ИУК, концентрация которой в данном случае составляет 0,4 мг/л, а укореняемость микропобегов винограда .82,57 Проведены три пассажа растений. Коэффициент размножения равен 1:330.П р и м е р 3. Способ осуществляют на сорте Русмол.В конце октября готовят невызрев шую часть основных и пасынковых побегов и приступают к вычленению и культивированию эксплантатов. Стерилизацию исходного материала осуществляют как у сортов Агат донской иВосторг, Также в стерильных условияхвычленяют 100 верхушечных меристем ипомещают их на среду Мурасиге-Скуга,содержание БАП в которой составляют0,2 мг/л,Через 6 нед иэ 100 высаженных меристем развивается 66 побегов длиной8-10 мм с четырьмя - пятью листочками. Базальные части этих побегов обрабатывают водным раствором 3-ИУК вконцентрации 99 мг/л и высаживают напитательную среду Мурасиге-Скуга следующего состава, мг/л: КАНОЭ 945;МНМОз 135; МяЯО 7 НО 183; СаС 1 хх 2 Н О 165; КНРО 67; Ре-хелат, микроэлементы, сахароза и рН оставалисьбез изменения, меэоиноэит 49 мг/л;пиридоксин О, 19 мг/л.В течение месяца 60 побегов укореняются и образуют оздоровленные растения, Через 2 нед приступают к ихмикроразмножению по технологии, идентичной примеру 1, эа исключением-ИУК, которую добавляют в питательную среду в концентрации 0,5 мг/л.Укореняемость микрочеренков при этомсоставляет 753, количество пассажейчетыре, коэффициент размножения 1::2500.П р и м е р 4. Способ осуществляли на сорте Ромулюс.В начале октября заготовили не вызревшую часть основных и пасынковых побегов. Побеги хранили во влажных опилках 1 мес. Во второй декаденоября приступили к вычленению и культивированию эксплантатов. Стерилизацию исходного материала проводилитак же, как и в предыдущих опытах.В асептических условиях под микроскопом вычленяют 100 верхушечныхмеристем и помещают на среду Мурасиге-Скуга с содержанием БАП 0,25 мл/л.Через 5 нед из 100 высаженных меристем развивается 50 побегов длиной8-10 мм с тремя - четырьмя листочками. Базальные части побегов обрабатывают водным раствором /3-ИУК вконцентрации 100 мг/л и высаживаютна питательную среду Мурасиге-Скугаследующего состава, мг/л: КИО 950;ИНИО138; МКЯО, 7 Н О 185; СаС 1 хх 2 Н О, 166; КН РО 68; Ге-хелат имикроэлементы оставались без изменения по Мурасиге-Скуга, мезоинозит 50;пиридоксин 0,2,В течение месяца 50 побегов укореняются и образуют оздоровленные растеЗаказ 3246 Тираж 485 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГЕНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб и, 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгороп, ул. Гагарина,101 ния, Через 2 нед приступают к их микроразмножению и адаптации по описанной технологии с содержанием3-ИУК 0,3 мг/л, как и в примере 1.5 До 1 июня сделано три пассажа и коэффициент размножения составляет 1:400.Использование предлагаемого спосо- ба позволяет получить безвирусный посадочный материал в большом количест О ве в ускоренный срок. 1. Способ размножения винограда п чдСго, включающий стерилизацию исходного материала, вычленение эксплантатов,посадку их на питательную среду Мурасиге-Скуга, содержащую б-бензиламинопурин, с последующим культивированием и дальнейшую высадку в теплицу для адаптации к условиям открытого грунта, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения выхода безвирусного посадочного матери ала и ускорения процесса размножения, в качестве исходного материала используют почки невызревших побегов, в качестве эксплантата - находящуюся в почке меристему, а культивирование осуществляют в три этапа, первым из которых является получение из эксплантатов побегов, вторым - укоренение полученных побегов и третьим - микро- размножение, при этом перед укоренением проводят обработку базальных концов побегов, полученных на первом этапе культивирования,-индолилуксусной кислотой, а укоренение осуществляют на безгормональной модифицированной среде Мурасиге-Скуга с уменьшенным вдвое содержанием макроэлементов и последующее микроразмножение осуществляют на той же питательной среде с добавлением -индолилуксусной кислоты.2. Способ по п.1, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что, с целью уменьшения сомаклональной изменчивости, на первом этапе культивирования в питательную среду вводят 6-бензиламинопурин в количестве 0,1-0,2 мг/л.3. Способ по пп. 1 и 2, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что 8 -индолилуксусную кислоту для обработки базальных концов побегов используют в концентрации 99-101 мг/и