Способ культивирования апикальных меристем сахарного тростника

"Б/ 10 Ег.,4 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТМ А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ юл. У 39иологии растенийаТереза Гонэалез (Спов и Р.Г,Бутен: ь(088.8) Тиггда 1 Ьа, 1986,ИВИРОВАНИЯ АПИКАЛЬРНОГО ТРОСТНИКА ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТпО изОБРетениям и ОтнРытиямпРи Гннт сссР(54) СПОСОБ КУЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ САХА Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам асептического культивирования клеток и тканей растений, и может быть использовано при культивировании апикальных меристем сахарного тростника.Цель изобретения - повышение жизнеспособности регенерантов и, выхода посадочного материала.Способ состоит в том, что в качестве исходного материала используют растения, выращенные в стерильных условиях, из этих растений вычленяют меристемы размером 400150 мкм и культивируют их на;питательной среде, включащцей микро- и макроэлементы, витамины, регулятор роста, агар и сахарозу с добавлением активированного угля 10-12 г/л, аденина 20-40 мг/л и гибберелловой кислоты 1-2 мг/л.Благодаря использованию растений, выращенных в стерильной среде, исключается опасность повреждения мери- стем при поверхностной стерилизации исходных растений, элиминируется от 2(57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к культивированию растительных клеток и тканей дп чйго. Целью изобретения является повыиение жизнеспособностям регенерантов и выхода посадочного материала. Способ состоит в том, что на модифицированной среде Мурасиге-Скуга кул тивируют меристеьаи размером 400 +50 мкм и в среду дополнительно добавляют 10-12 г/л активированиого угля, 20-40 мг/л аденина и 1-2 мг/л гибберелловой кислоты. б. табл. рицательное воздействие стерилиэующих веществ на апикальные"меристемы и обеспечивается физиологическая однородность меристем, что очень важно при выполнении биотехнологических экспериментов. Питательная среда разработана таким образом, чтобы обеспечить регенерацию растений иэ меристем малого размера (400+50 мкм) что необходимо при выполнении работ по освобождению от вирусов ценных сортообразцов сахарного тростника. Кинетин в концентрации 0,5 мг/л индуцирует .рост меристем давлением клеток и исключает опасность образования каллуса. Повышение концентрации кинетина нежелательно в связи с опасностью получения хромосомных аббераций и утраты сортовых качеств. Для усиления цитокининового действия и снижения токсического влияния кинетина в состав среды введен аденин, Гибберелловая кислота в концентрации 1-2 мг/л обеспечивает синергизм действия цитокининов и способствует росту регенерантов в длину. Лктивированный уголь поглощаетингибиторыроста, выделяемые регенерантом, чтоликвидирует опасность самоотравлениярегенерантов. Такой набор регуляторовроста в комплексе обеспечивает условия развития растений-регенерантовиз меристем сахарного тростника малого размера.Способ осуществляется следующимобразом.Из стерильных растений сахарноготростника вычленяют апикальные меристемы размером 400+50 мкм и культивируют их в течение 25-40 сут при20-26 С и освещении лампами дневногосвета с интенсивностью 5-8 тыс. лк ифотопериодом 16 ч в сутки на питательной среде, включающей микро- имакроэлементы по прописи МурасигеСкуга, агар 7 г/л, сахарозу 20 г/л,регулятор роста (кинетин) 0,5 мг/лс добавлением активированного угля10-12 г/л аденин 20-50 мг/л и гиббеФ 25релловую кислоту 1-2 мг/л. Для ускорения растения-регенеранты переносятна аналогичную среду, в которой активированный уголь и регуляторы заменяют смесью, состоящей иэ:индолилуксусной кислоты 1 кг/л, кинетина0,05 мг/л и феруловой кислоты 2 кг/л,Укоренившиеся растения-регенерантывысаживают в почву и используютпо назначению,П р и и е р 1. Стерильные растения сахарного тростника сортаСкультивируют на питательнойсреде в течение 120 сут. В стерильных условиях растения извлекают изколб и используют из них меристемыразмером 400+50 мкм или размером1250+250 мкм. Сразу после вычленениямеристемы высаживают на питательнуюсреду, включающую минеральные элементы по прописи Г 1 урасиге-Скуга, витамины по прописи Стаба, сахарозу20 г/л, агар 7 г/л, активированныйуголь 10 г/л, кинетин 0,5 мг/л, аденин 40 мг/л и гибберелловую кислоту2 мг/л. Одновременно часть мерйстем 50высаживали по известньм способам.оМеристемы культивируют при 22-24 С,интенсивности освещения 8000 лк и16-часовом фотопериоде в течение30 сут, Полученные результаты представлены в табл, 1.П р и м е р 2, Выращивают исходные растения и изолируют меристемы.как в примере 1, Меристемы высаживают по предлагаемому способу либона полную среду, либо на среду безактивированного угля. Полученныерезультаты представлены в табл. 2,Активированный уголь, следовательно,играет важную роль в процессе ростаи развития изолированных меристемсахарного тростникаП р и м е р 3. Стерильные растения сахарного тростника выращиваюткак в примере 1, Меристемы размером400+50 мкм изолируют и высаживаютпо предлагаемому, способу на средус разной концентрацией аденина. Культивирование меристем проводят как впримере 1. Полученные результатыпредставлены в табл, 3,Наиболее эффективной являетсяконцентрация 40 мг/л, а при концентрации 20 или 60 мг/л снижается скорость роста регенерантов.П р и м е р 4. Стерильные, растения сахарного тростника выращиваюткак в примере 1. Меристемы размером400+50.мкм вычленяют и высаживаютпо предлагаемому способу на средус разной концентрацией гибберелловойкислоты. Культивирование меристемпроводят как в примере 1. Полученные данные представлены в табл. 4.Наибольшую скорость роста обеспечили концентрации 1,0 и 2,0 мг/л,П р и м е р 5, Стерильные пробирочные растения выращивают как впримере 1. Меристемы размером 400++50 мкм вычленяли и высаживали попредлагаемому способу, Культивирование проводят как в примере 1. Варианты различаются по виду и концентрации цитокинина, Полученные данныепредставлены в табл. 5.Полученные данные показывают,что для испытанных .цитокининов лучшими концентрациями являются 0,30,6 мг/л, Дальнейшее повышение концентрации неприемлемо, так как повышение концентрации цитокининов выше 1,1 мг/л вызывает увеличение частоты хромосомных аббераций и, следовательно, может привести к нарушениюнаследственности. П р и м е р 6, Стерильные пробирочные растения выращивают как в примере 1. 11 еристемы размером 400+ +50 мкм вычленяют и высаживают по предлагаемому способу, Культивирование проводят как в примере 1. Варианты различаются по освещенности,5861505704212430007255 Известный 2700 972 2925 9000 36640 едлагаемыи П р н м е ч а н и е. В числителе результаты, полученные с меристемами исходного размера 400+50 мкв знаменателе - размера 1250+250 мкм. блица Число растений регенерантов,Длина черП р и м е ч а н и е. В числителе релученные с меристемами исходного раэмев знаменателе - размера 1250+250 мкм. льтаты, по+50 мкм,5 160 лампы люминесцентные ЛБ"80, дающие белый дневной свет, фотопериод 16 чПредлагаемый способ позволяет укоренять побеги после их регенерации в стерильных условиях, а не в грунте, что облегчает и ускоряет адаптацию растений, предотвращая их гибель при последующей пересадке их в грунт в оранжерее.Формула и з о б р е т е н и я Способ культивирования апикальных меристем сахарного тростника, включающий вычленение меристем, посадку 1118 6их на модифицированную питательнуюсреду Мурасиге"Скуга, культивирьвание до получения регенерантов, о т - 5л и ч а ю щ и й с я тем что с це) 9лью повышения жизнеспособности регенерантов и выхода посадочного материала, вычленяют меристемы размером350-450 мкм из растений, культивируемых в стерильных условиях, и в питательную среду дополнительно добавляют активированный уголь в количестве1 Ог/л, аденин в количестве 2040 мг/л и гибберелловую кислоту в количестве 1-2 мг/л.1601118 Таблица 3 Концент ация енина мг/л Показатели Р ад0 10 20 40 60 Длина регенеранта, мкмЧисло регенерантов через21 день, 7 908 1686 2343 4050 3704 86 ЭЭ гоо гоо Таблица 4 Концентрация гибберелловой кислоты, мг/лПоказатели т 0,1 1,0 2,0 0 20,0 Длина регенерантов, мкм через время, дн921Число регенерантов, 7 2132 2654 3032 530886 83 2741 2820 1800 9067 6596, 3568 83 83 100 Таблица 5 Размер эксплантата после 2-недельного культивирования; мм