Способ микроклонального размножения карельской березы

(19) Ц 1) 1)5 С 12 Б 5/ АНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ ЛЬСТ Изобретен тносится к биотехся создания лесных нтивнологии и кас ой тся упроования, по аллу- среде ого материа ческой статрал еген с Спо состоит в ют н иге-Скуга 0,5-3,0 м е и при 26 в темно узловые зования ками) с срезают среде М в контр стеблевые с на них спло оя каллуса,и рекультиви расиге-Скуга олируемых усло ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЦТИПРИ ГКНТ СССР К АВТОРСКОМУ СВИ(56) СЬа 1 цра Ч. 1 п ч 1 го ргорадагоп ой В 1 гсЬ (Веги 1 а чегг 1 созеЕЬгЬ) . - В 1 о 1, р 1 апй, 1981, ч. 23,Нф 6, р, 472-474,(54) СПОСОБ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ КАРЕЛЬСКОР БЕРЕЗЫ(57) Изобретение относится к биотехлогии и касается микроклональногоразмножения растений,.в частности культур плантационногоЦелью изобретения яв щение процесса культиви вышение выхода размножа а и повышение его генеильности. том, что на срефитогормонамил; БАП 0,5 мг/л)инкубируют межгменты до обраного (или участкоторый затем руют на свежейс БАП 1 мг/л виях (освещендревесной культуры - карельской бере-зы. Целью изобретения является упрощение процесса культивирования, повышение выхода размножаемого материалаи повышение его генетической стабильности. Способ состоит в том, что стеблевые эксплантаты помещают на модифицированную среду Иурасиге-Скуга, получают на ней каллус и побеги, которые переносят на безгормональную среду Буле, где получают регенерантыи проводят их мультипликацию путемпоследовательного и многократногомикрочеренкования. Затем размноженныйматериал высаживают в пленочные теплицы и открытый грунт. 1 з.п, ф-лы,1 табл. ность 3-4 клк в течение 24 ч 25-26 С) до формирования адв ных почек, которые при повто пересадке культур формируютс беги, Последние изолируют иэ са, укореняют и доращивают н Буле без гормонов в тех же к руемых условиях. Полученные ранты разрезают на микрочере одной почкой и снова выращива тои же среде. Процесс микрочеренко 1 вания повторяют несколько раэ до по лучения необходимого количества растений, которые затем высаживают в горшочки с субстратом (торф и песок), доращивают в минитеплицах в течение 2-4 мес с постепенным снижением влажности до естестеннои величины и переносят в .пле1597386 Схема микроклонального размножения карельской березы: Подготовка эксплантатов(стерилизация, удаление коры, сегментирование побегов) Культивирование на питательной средедля каллусообразования (среда Р 1)Отделение каллуса от эксплантата,культивирование на среде для индукции побегов (среда В 2)Изоляция побегов из каллуса, выращивание их на среде для роста иобразования корней (среда Ф 3)Микрочеренкование регенерантов ивыращивание черенков на среде Р 3Мультипликация черенковых растенийпутем последовательного и многократ- -,ного микрочеренкования на среду Р 3 Перенос черенковых растений в субстрат, доращивание в минитеплицах при контролируемых ус- ловиях Перенос растений в пленочную теплицу, доращивание, закаливание ночные теплицы для закаливания доконца вегетационного периода. Способ клонального микроразмножения карельской березы осуществляют следующим образом.35Со взрослого дерева карельской березы (30 лет) срезают ветви и помещают в воду до появления на них листьев. Далее отрезки побегов величиной 15-20 см протирают спиртом4 О (96%), стерилизуют в 3%-ном растворе хлорамина в течение 45 мин, трижды промывают стерильной водой и после удаления с них коры разрезают на сегменты до 1-1,5 см каждый.45Питательные среды для каллусообразования (среда Р 1) и индуцированного морфогенеза (среда Р 2) готовят согласно прописи Мурасиге-Скуга, Исключение составляют: агар 0,6%; сахароза 2%; инозит 100 мг/л; аскорбиновая кислота 1 мг/л; глицин 2 мг/л; глютамин 0-25 мг/л; глютатион и гидрблиэат казенка не используют, В качестве индукторов каллусообразования в среду Р 1 вводят 2,4-Д в концентра 55 ции 0,5-3,0 мг/л и БАП 0,5 мг/л. Мор 1 фоиндукторами в среде Ф 2 служат БЛП и ИУК в концентрациях соответственно На следующей схеме представлены все этапы клонального микроразмножения карельской березы,1,0 и 0,1 мг/л. Среду для усиления роста и укоренения побегов (среда У 3) готовят согласно прописи Буле без добавления фитогормонов. Все питательные среды стерилизуют в авто- клаве при 1 атм в течение 20 мин,Простерилизованные сегменты помещают горизонтально на среду У 1о и инкубируют в темноте при 26 С. Через 2 - 4 нед. на стеблевых сег- ментах (эксплантатах) формируется каллус в виде сплошного слоя или отдельными участками, Эффективность каллусообраэования на средах с разным содержанием 2,4-Д различна: минимальная при концентрации 0,5 мг/л (около 10% культур) и максимальная при 3 мг/л (00% культур). Образовавшуюся каллусную ткань срезают и культивируют при контролируемых условиях: круглосуточное освещение при 25 26 С и освещенности 3-4 клк..Через 4 нед. среди выращиваемых культур выделяют 3 типа каллусов: хорошорастущие желтого и равномерно- зеленого цвета и растущие несколько ,хуже с плотными темно-зелеными участ 5 15 ками. Каллусов последнего типа отмечается больше, если первичная среда У 1 содержит 2,4-Л в концентйрации 0,5 мг/л, и значительно меньше, если количество 2,4-Д составляет 3 мг/л. Повторное выращивание каллусов на среде 9 2 приводит к образованию почек в культурах 3-го типа в количестве 5-10 шт. на одну культуру. Каллусы желтого и равномерно-зеленого цвета выраженных морфогенных признаков не проявляют и из дальнейшихопытов исключены. Почки, индуцированные в каллусе, через 3-4 нед, формируются в побеги, которые при достижении 1-1,5 см изолируют, помещая на среду 9 3. Процессы образования корней и роста побегов происходят одно.временно, Укорененные регенеранты величиной 4-6 см разрезают на узловые микрочеренки, которые также выращивают на среде Р 3. Образовавшиеся черенковые растения вновь черенкуют и через 3-4 нед, из черенков получают новый материал, пригодный к следующему черенкованию. В условиях указанного режима проводят 4 цикла черенкования, на протяжении которых сохраняются 100 Х-ная укореняемость черенков и интенсивный рост пазушных побегов. При первом цикле от каждого регенеранта получают по 2-3 микрочеренка, при последующих - количество черенков от каждого растения увеличивается до .4-5. При изменении условий эксперимента: увеличении освещенности до 8- 9 клк и уменьшении фотопериода до 16 ч, отмечают заметное торможение роста и укоренения черенков.Укрепленные черенковые растения высотой от 3 до 6 см извлекают из культуральных сосудов и высаживают в субстрат из торфа и песка (1:1), предварительно промытого и прокаленного, Растения доращивают при повышенной влажности воздуха в полиэтиленовых или пластмассовых минитеплицах при контролируемом режиме в течение 1-4 мес. В пленочную теплицу в естественных условиях растения переводят в мае и нале, при этом высота их варьирует от 3 до 40 см в зависимости от длительности доращивания в контролируемых условиях. Выживаемость растений к концу вегетационного периода составляет 1007П р и м е р 1, В соответствии с приведенной методикой проводят97386 10 15 20 25 30 35 40 45 50 последовательно посадку эксплантатов на среду, получают растения-регенеранты и проводят их клональную мультипликацию путем многократного и последовательного черенкования при этом. в питательную среду для каллусообразования вносят 0,5 мг/л 2,4-Л При .анализе полученного размножаемого растительного материала видно, что при высокой морфогенной активности не проявляется самоклональная изменчивость и отмечается 1007-ная жизнеспособность размножаемого материала.П р и м е р ы 2 и 3. Аналогично примеру 1 используют 2,4-Д в концентрациях 2 и 3 мг/л, при этом отмечают более интенсивное каллусообразование, однако, вместе с тем, повышается вероятность сомаклональной изменчивости.Показатели роста растений, высаженных в пленочную теплицу в разное время, представлены в таблице.Использование предлагаемого способа клонального микроразмножения карельской березы обеспечивает по сравнению с известными способами следующие преимущества. Сочетание индуцированного морфогенеза в первичном каллусе с микрочеренкованием образующихся регенерантов позволяет размножать взрослые деревья с большой эф фективностью и уменьшением или исключением вообще генетической вариабельности вегетативного потомства, Использование микрочеренкования на безгормональной среде Буле позволяет из ограниченного количества исходного материала за короткий срок получить массовое количество жизнеспособных растений. Согласно расчетам, полученным на основании проведенных экспериментов, из одного регенеранта за год можно получить более 1 млн. черенков растений. Внедрение способа в производство позволяет эа короткий срок создать плантации карельской березы. обладающей наиболее выраженными декоративными свойствами древесины. Формула изобретения 1. Способ микроклонального размножения карельской березы, включающий посадку эксплантатов на модифицированную питательную среду МурасигеСкуга, индукцию первичного каллуса, побегообразование на ней, получение1597386 а получение регенерантов и их мультипликацию осуществляют на безгормональной среде Буле.Группа Зависимость ростовых показателей от времени высадки в теплицу Иай Июль Средняя высота растений, см Среднийприрост,см Средняя высота растений,см Средний приростсм Исходная К концу вегетативного периода Исходная К концу вегетативного периода 45,8 605 14,8 25,5 31,0 5,135,0 13,0 13,4 28,8 8315,8 Составитель В.ЛемкинТехред И,Дидьк КорректорЛ.Бескид Редактор И,1 ербак Заказ 3032 Тираж 48 б Подписноекииттз о изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР .1 оскв, ЖРаушская иаб., д. 4/5 ВНБ 1 ПИ Государствеого1 )35,11 роизводствеиио-пз.",те, сй гат Патент , г.ужород, ул. Гагарина,13 регенерантов, их мультипликацию, доращивание и закаливание с последующей пересадкой в открытый грунт, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения процесса культивирования, повышения выхода размножаемогоматериала и повышения его генетической стабильности, в качестве эксплантатов используют стеблевые сегменты,2, Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что мультипликацию ре" генерантов проводят путем многократного и последовательного микрочеренкования.