Способ выделения катепсина в из ткани почки

НИЯ КАТЕПСИНА. ВОСУДАРСТВЕННЬЙ НОМИТЕТ ССС О делАм изОБРетений и ОткРы К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ 3926890/28-1421.05.8530.01.87. Бюл. Яц 4Витебский медицинский институтИ,Г. Щербак и Л.Н. Кирпиченок615.45 (088.8)Жлоба А.А, и др, Биохимия, 197вып. 12, с. 2218-2226.(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕ ЛЗ ТКАНИ ПОЧКИ(57) Изобретение относится к биохимии, в частности к методам выделения биологически активных веществ. Целью является повьппение выхода катепсина В и одновременного выделения ингибитора катепсина. Образец ткани почки подвергают аутолизу в течениео 20-25 ч при температуре 37 С, гомогенизируют, гомогенат обрабатывают3-4 мИ дитиотреитолом, центрифугирПолученный экстракт ткани осаждаютсульфатом аммония (0,4 от насыщения), осадок отбрасывают, белки недоосадочной жидкости вновь осаждаюсульфатом аммония (0,7 от насыщениБелки, выпадающие в осадок при такконцентрации сульфата аммония, используют для выделения катепсина Ва надосадочную жидкость после диализа - для очистки эндогенного ингибтора цистеиновых протеиназ. Последующее применение афинной хроматогфии на папани-сефарозе позволяеточистить ингибитор в 1010 раз с выходом 467 Степень очистки катепсина В в результате хроматографии насефадексе 0-75 в 247 раз с удельнойактивностью 155,6 ед/мг белка.2 таб1 1286626 2Изобретение относится к биохимии, рожно перемешивают на шейкере 2 ч в частности к методам выделения био- при комнатной температуре. Для удалелогически активных веществ. ния избытка неспецифически адсорбиЦелью изобретения является повы- рованного белка проводят последовашение выхода катепсина В и одновре тельную отмывку геля 0,5 М ИаС 1 в менного выделения ингибитора катеп- О, 1 М бикарбонатном буфере, рН 8,3, сина. затем - 0,5 М ИаС 1 в 0,01 М ацетатСпособ осуществляют следующим об- ном буфере рН 4,0 и 20 мМ калий-фосразом. фатным буфером, рН 6,0. ПригодностьП р и м е р 50 г структурирован папаин-сефарозы контролируют по ее ной (в цельном куске) ткани почки че- способности гидролизовать БАПНА, ловека подвергают аутолизу в течение Связывание ингибитора с лигандома24 ч при 37 С. Затем ткань гомогене- проводят статическим методом, несвязируют в 100 мл дистиллированной во- завшиеся белки элюируют 0,02 М фосды, в гомогенат добавляют дитиотре- фатным буфером, содержащим 0,5 М хлоитол в концентрации 4 ьИ, гомогенат рида натрия. Ингибитор элюируют помещают на 2 ч в термостат при 37 С, 10 мМ соляной кислотой, затем нейзатем центрифугируют при 1500 р трализуют 0,01 н ИаОН до рН 6,0. Пас мин при 4 С. Полученный экстракт саж супернатанта после кислотногооткани осаждают сульфатом аммония фракционирования через колонку с па- (0,4 от насыщения), осадок отбрасы- паин-сефарозой проводят 3-4 раза (до вают, а белки надосадочной жидкости исчезновения в растворе ингибируювновь осаждают сульфатом аммония (0,7 щей активности). Полученный после от насыщения). Белки, выпадающие в афинной хроматографии раствор инги- осадок нри такой концентрации суль- битора подвергают концентрированию Фата аммония, используют для выделе- в диализных мешочках на сухой сахания катепсина В, а надосадочную жид- розе. Ингибирующую активность в про. кость после диализа (против 50-крат- цессе выделения определяют па инги- ного объема дистиллированной воды) - бированию очищенного гель-Фильтрадля очистки эндогенного ингибитораЗоцией на сефадексе Спапаина (К.ф. цистеиновых протеиназ. После диализа 3,4.22.2). Единица ингибирования соот. проводят кислотное Фракционирование; ветствует угнетению 1 мг фермента. термообработка 20 мин при рН 2,5 и Ферментативную активность папаина и температуре 85 С, нейтрализация раст- катепсина В измеряют по расщеплению вора О, 1 н ИаОН и отделение осадка 35 р-нитроанилида ж -И-бензоил-Ь,Д-аргицентрифугированием при 22500 я 30 мин. нина.Полученную надосадочную жидкость подвергают афинной хроматографии на ко-При выделении катепсина В осадок лонке 2,31,5 см с папаин-сефарозой. после фракционирования сульфатом амОбработку ВгСИ-активированной сефаро- мония (0,7 до насыщения) ресуспензизы проводят строго по рекомендаций руют в 0,01 М фосфатном буфере рН 6,9 фирмы-изготовителя (Рагшасха Гдпе с 10 мМ ЭДТА и наносят на колонку СЬешЫИв)4,0 г ВгСИ-сефарозы отмы бх 2,3 см/с сефадексом С, уравновают 800,0 мл 1 мМ НС 1 и оставляют вешанную этим же буфером. В резульнабухать 1 сут на фильтреиз матиро- тате хроматографии получают два пика ванного стекла, Приготовление папани- ферментативной активности: первый пик сефарозы проводят по способу (Копапа- содержит нетиоловые гидролазы (не ш. Е., Масашайвц М. ВаосЬеш. апй ингибируются р-хлормеркурийбензоатомВорЬув. Кез Сошпюп. 1981, 99, У 2, ПХМБ в концентрации 1 мМ), фракции р. 568-575). 100 мг папаина в 0,1 М 50 второго пика, чувствительные к ПХМБ, бикарбонатном буфере с 0,5 М ИаС 1 объединяют и обозначают катепсином В. рН 8,3 смешивают с гелем на шейкере В используемой для выделения ин ч при комнатной температуре, Затем гибитора надосадочной жидкости удельнесвязавшийся папаин отмывают 0,1 М ная активность ингибитора в 19 раз бикарбонатным буфером с 0,5 М ИаС 1 55 выше, чем в исходном экстракте тка- рН 8,3. Для блокирования оставшихся, ни, выход ингибитора на этом этапеактивных групп в гель добавляют составляет 343. Применение последую 100 мл 0,2 М глицина рН 8,0 и осто- щей афинной хроматографии на папаин1286626 Формула изобретения Таблица 1Способ одновременной очистки катепсина В и его эндогенного ингибитораиз почки человека. Эффективность этапов очистки ингибитора. А - безобработки ткани, Б - обработка аутолизом и дитиотреитолом,Выход, СтеХ пень очис,2 9 Надосадочная послефракционирования 703 04 3 156 5 0,08 0,022 8 Афинная хроматография напапаин-сефарозе 9 2 2 0,5 3 1,7 0,08 О,010 58 0,098 а н и е. За единицу ингибитора принимали такое его количест которое угнетало активность 1 мг папаина.сефарозе позволяет очистить ингибитор в 256 раз с выходом 97 (табл.1).При проведении предварительного аутолиза структурированной ткани и обработке гомогената дитиотреитолом удельная активность ингибитора в надосадочной жидкости после солевого фракционирования (0,7 от насыщения сульфата .аммония) по сравнению с экстрактом ткани возрастает в 53 раза, выход ингибитора составляет 557. При этом последующая хроматография на папани-сефарозе позволяет очистить ингибитор в 1010 раз с выходом 467, т.е, при такой обработке степень очистки ингибитора увеличивается в .4, а его выход - в 5 раз (табл. 1), Кроме того, проведение аутолиза ткани в сочетании с обработкой гомогената дитиотреитолом без введения дополнительных стадий очистки позволяет увеличить выход катепсина В в 2 раза (табл.2). Способ выделения катепсина В изткани почки путем гомогенизацииткани, инкубации гомогената, центрифугирования, фракционирования сульфатом аммония полученного экстрактас последующей очисткой катепсина Вметодом гель-фильтрации, о т л и ч а ю щ и й с я тем,что, с целью повышения выхода катепсина В и одновременноговыделения ингибитора катепсина, предварительно участок ткани подвергаютаутолизу в течение 20-25 часов при 15 физиологической температуре, гомогенат перед инкубацией обрабатывают дитиотреитолом в концентрации3-4 мМ , для выделения ингибитора используют надосадочную 20 жидкость после осаждения катепсина , а очистку последнеговедут с помощью афннной хроматографии.1286626 5 Таблица 2 Способ одновременной очистки кетепсина В и его эндогенного ингибитора из почки человека, Эффективность этапов очистки катепсина В,Этапы выделения Объем, мл ностьвсего единиц 100 36,5 14,6 0,4 А Экстрактткани 23, 12.0,63 Б 100 36,7 21,6 29,6 263 247 П р и м е ч а н и е. За единицу ферментативной активности принимали такое количество катепсина В, которое приводило к образованию 1 мкмоль продукта за 1 ч. Составитель Л. ШилинаТехред Л.Сердокова Корректор И. Муска Редактор Н. Горват Заказ 7684/26 Тираж 500 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5,Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул, Проектная,4 Осадок после Афракционирования 707 Б Гель-фильтрация на се- Афадексе,СБ 6 2,6 57,2 5 11,48 161,8 25 009 99 29 0,158 24,7 тивностьединиц/мгбелка 107,2155,6 1430 100 2312 100 343 24 54 809 35 47 248 17 717 31