Способ разделения нуклеиновых кислот

.с е евЬ УДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ ССС ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫ(71) Научно"исследовательский конструкторско-технологический институт биологически активных веществ (72) С;Ф. Карпова, В.И. Пупкова и ЮЛ. Хрипин(56) Осашого М, Чашка Р, ТЬе ЕНесй ог МейЬУ 1 епе СЬатп 1 ещгЬ оп СЬе СЬгоаа СоягарЫе ВеЬачоог ой АпапоЬопйей зх 1 саз ).и НдЬ"Регйотшапсе ТЬп Ьауег СЬгошайо 8 гарЬу,-СЬгоша 1 о 8 гарМа, 1982, ч.6, р.152-154;Лоп 1 Ю., Наоск Н.Е. А МойЫ).ей Н 18 Ь-Регйогшапсе ТМп 1.ауег р 1 агез 6)г йЬе Зерагай).оп оГ Рпг).пез апй Руг 1 рЫ 1.пез-Апа 1 Вос 1 еш 1983, ч.135, У 1, р.120-127.(54) СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЗЮТ(57) Изобретение относится к аналитической химии, в частности к анализунуклеиновых кислот методом тонкослойной хроматографии и может быть использовано при идентификации этихкислот и сопутствующих им компонентов . Цель - упрощение и повышениеселективности способа. Анализ проводят на аминопропилированном силнкагеле, используя в качестве подвижнойфазы смесь 0,9-1,1 М водного растворауксусной кислоты и этанола лри соотношении компонентов О:1. Применение2 М СН СООН в составе подвижной фазыразруйает люминофор, и фон пластинкитемнеет. Указанные условия обеспечивают хорошее разделение смеси рибонуклеотидов или дезоксинуклеотидов,т,е. К имеют разные значения,в то время как в известном способе значения Йдля разных компонентов совпадают, и поэтому разделение не достигается. 4 табл.30 Та б л и т а 1 Величины К в системах с различнойконцентрацйей уксусной кислоты Разделяемые компоненты 0,73 9720,72 Аденозин 0,72 0,73 0,75 1 Апеноэин-монофосфат0 0 0 0 0 0 12Изобретение относится к аналитической химии, в частности к методутонкослойной хроматографии, и можетиспользоваться в аналитических исследовательских лабораториях при анализе нуклеиновых кислотЦелью изобретения является упрощение способа .и повышение его селективности,Разделение анализируемой. пробыосуществляют на пластине "СилуфолУФ", пластину погружают в 1,02,07."ный раствор аминоцропилтриэтоксисилана в .этиловом спирте, выдерживают 50-60 мин, после. чего вынимают,подсушивают 20-30 мин на воздухе ипромывают 1 раз этиловым спиртом,На аминопропилированную пластинунаносят раствор анализируемого препарата с концентрацией 2-5 мг/мл ипроводят развитие хроматограммы всистеме 0,9-1,1 М водного растворауксусной кислоты и этилового спирта(10:1).Процесс развития хроматограммыосуществляют в камере (120 х 200 см),насыщенной в течение 1 О мин парамиподвижной фазы.Пластину с развитой хроматограммойвынимают иэ камеры и просматривают,под хемископом в УФ- свете, контурыпятен обводят карандашом, измеряютКкаждого пятна, идентифицируя ихпо сравнению с эталонными образцами,величины Ккоторых определены аналогичным оораэом ранее,П р и м ер 1. На аминопропилированную пластину (5 х 1 О см) "Силуфол УФ" наносят 4 мкл растворауридин-монофосфата в 0,1 М МН ОН 39588 2(концентрация 5 мг/мл), содержащегопримеси цитидин-монофосфата, адепозин-монофосфата, уридина, аденоэина. Пластину с нанесенной на нееанализируемой смесью помещают в камеру, насыщенную парами подвижной фазы1 М водного раствора уксусной кислотыи этанола при соотношении компонентов 1 О;1, Величины К разделенныхкомпонентов равны для уридин-"монофосфата 0; аденозин-моно 4 осфата 0,22; цитидин-монофосфата0,43; аденозина 0,69; уридина 0,76.П р и м е р 2. На аминопропили рованные пластины (5 х 10 см) Силу-,фол УФ" наносят по 4 мкл смеси,содержащей аденозин, аденозин-монофосфат и уридин-монофосфат в0,1 М ИН.ОН, Пластины подсушивают на 2 О воздухе и помещают в камеру (120 хх 200 см), насыщенную парами применяемой подвижной фазы в течение10 мин. Проводят восходящую хроматографию в системах растворителей при р 5 соотношении компонентов (10:1): 1) 0,25 М СН СООН-С Н ОН; 2) О 50 М СН СООН С Н ОН 3) 0,9 М СН СООН-С Н ОН; 4) 1,0 М СН СООНС Е ОН; 5) 1,1 М СН СООН С Н ОН,Э 5 6) 2,0 М СН СООН-С Н ОН; Влияние концентрации уксусной кислоты в подвижной фазе на селектив 40 ность иллюстрируется табл,1.2395884вижной фазе, используемой в извест- ном способе 0,2 ИйаС 1 в смесиСе Н ОН-Н О (30: 70)Величины К рибонуклеотидов идезоксинуклеотндов приведены .втабл.3. Таблица 3 П р и м е р 3. Анализ компонен- Компонент тов нуклеиновых кислот проводят,как в примере 1,.но варьируют объемное соотношение компонентов элюирую, щей системы. Данные по разделению Предлага- Известемый иый анализируемых компонентов нуклеиновых кисот и веичиы К представлены в табл,2.Влияние объемного соотношения компонентов подвижной фазы на величины К представлены в табл.2.Та блица 2 20 Уридин монофосфат 0,25 0,2 Цитидин- монофосфат 0)25 0,4 1 Аденозинмонофосфат.35 монофосфат 0,14 0,22 0)11 0,20 0,30 Дезокси" гуаноэин 40 монофосфат 0,14 0,14 0 Из табл.2 следует, что наилучшее. разделение происходит при соотношении компонентов в подвижной фазе 10:1,П р и м е р 4. Разделение смеси рибонуклеотидов и дезоксинуклеотидов проводят в подвижной фазе 0,9- 1,1 М СН СООБ С Н ОН (10.1) и в под 3 1Из данных табл.1 следует, чтонаилучшая селективность достигаетсяпри применении подвижной фазы 0,91,1 М СН СООН-С Н ОН.Применение 2 М СН СООН в составеподвижной фазы нецелесообразно, таккак высокая концентрация разрушаетлюминофор и фон пластины темнеет.Цитидин-онофосфат 0,34 0,43 0,313Уридин-онофосфат , . 0 0 Из данных табл,3 видно, что в известном способе .смесь рибонуклеотидов и смесь дезоксинуклеотидов не разделяется.П р и м е р 5. Разделение (анало- гично примеру 1) нуклеозидов и ихфосфатов осуществляют в подвижной фазе 0,9-1,1 М СН СООН-С Н ОН при соотношении компонентов 10:1.Величины К нуклеозидов и их фосфатов в системе даны в табл,4.239588 1 Разделяемые компоненты 0,75 Де зок сицитидии ДеэоксиаденозинДезокеицитидин монофосфатДезоксиаденозин монофосфат 0,55 0,62 Дезоксиаденозин дифосфат Дезоксицитидин дифосфат 0,56 0,39 Деэоксицитидин трифосфат ФДезоксиаденозин трифосфат. 0,44 0,19 Гуанозин Дезоксигуанозин 0,71 Дезоксигуаноэин-0,53 0,56 Дезоксигуанозин дифосфат 1Гуанозин дифосфат 0,41 0,30 Дезоксигуанозин трифосфат Гуанозин трифосфат 010 0,12 0,74 УридинУридин-монофосфат 0,79 0,51 0,66 Уридин-дифосфат 0,59 0,57 Уридинтрифосфат 0,79 0,44 Цитидин. 0,76 Цитидин 5 -монофосфатЦитидин-дифосфат 0,60 0,54 1 Цитидинтрифосфат0 38 Иэ. данных табл.4 следует, что в предлагаемом способе достигается селективное разделение, фосфорных производных рибо- и дезоксинуклео" тидов.50 формула изобретения Способ разделения нуклеиновых кислот методом тоикослойной хроматогра 55ВНИИПИ Заказ 3389/43 Тираж 778 Подписное Произв.-полигр. лр."тие, г, Ужгород, ул.Проектная, 4 АденозинАденозинмонофосфатАденозин-дифосфатАденозин-трифосфат Разделяемые к 6 мйоненты К фии на пластине, покрытой силикагелем, содержащим на поверхности аминопропильиые группы, в подвижной фазе на основе этанола,о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа и повышения его селективности, в качестве подвижной фазы используют смесь 0,9-1,1 М водного рас твора уксусной кислоты и этанола при соотношении компонентов 10:1.