Способ получения липосом

союз соаетскисоциллистичнли 5РЕСПУБЛИК ДНИ БРЕГЕ ДЦФ Унее 4 афифа Ъш 1 Ч а д НТУ 5. Бал ШнейдеМемор ,8(088 П Л е 1 г 19-302. В 1 ос 457, Г 11 253 3/02 1 поверхностно водонераство ворителе с и лиггггцогз г раствор активного мом оргяг вещес я ическом тразвук удаление рас ющийс л гощью у отличато в качествельзуют 0,15 М й с я тем, ря солей ис рителл, отем, что, по стгс дггс смеси доб твор соле га щ и раств раство5, щий рощения спос я к полученн с целью у ергггрован йаслорида натри являют в или воднши рчат перемешив лич аю.честве инкап о Способ по п. с я тем, чт эмульгир аляют раств ия газа и о в те:гь путем нки и т пем и у пропуск гонки п ли о и пе щества,менты или оггижеггног нием или давлеосле ульгиро го. СУДАРСТВЕННЫИ НОМИТЕТ СССР О ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТ(54) (57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧБ 11 И 51 ЛППОСОМ, вкгцачающий диспергирование инкапсулиемои жидкости в прис;тствии ос 1 оП Л 61 К 9/50//Л 61 К 9/ 2, Способ по п.1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве нерастворимого в воде растворителя используют бензол, алкин- и газоялкилбензолы, алифятические эфиры, альлегггдьг, сложные эфиры, кетоны, свободные и галогенированные алифатпческие и циклоалифатические углеводороды,3, Способ по и.1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве липидов используют вещества из группы леггитина, фосфатидил-этагголамина, лизолецитина. лизофосфатидил-этаноламина, фосфатидилсерина, фосфатидипинозитола, сфингомиэлпна, кардиоли- Я пина, фосфатной кислоты, цереброзидя, стеариламина, дипальмитоилфосфатидилхолина или смеси одного Сфосфолипида, холестерона и токоферола.4. Способ по п.1 сулируемого вещества используюкрасители, ароматические велекарственные средства, ферполипептиды.1 эбретение относится к медицине,и:Рно к спссобу получения пцпосом,1 г.ь )т 3 обретР)тия - угРощение споз сП - и и е р 1. В 10-милпилитро .уо . 3 Гс:сс 0 ус колбу помещают 2 мл )Обг ".-,:Гс с го гростого эфира и 1 мл сТ 11 с-РГс а:я затем добавл)пот 0,2 мл иксу.",нового раствора 10 мг/л в с;.)1 Э; г;С-НОМ ЯСГ, ПРИ РН 3, ЗатЕМ 1 с тудяобявляот 150 мг дипальмитоил- (Ъэсфя г)Т 15 хогина (гидрофильно;133370113:31 с 0 соединение) и 1 ри комят)ой температуре гомогенную смесь тодве 1)гяст действио ультразвука в 15 Т-.ЧГ 1 ИМИН С ПОМОЩЬЮ ГЕНЕРатОРа "Бс)У",0:" (г одепь В20 сГцр 15 С Вт), Пс:учают прозрачный раство;, ,.,".Ящий липосомные предшРст 3,.;Нчс: . , Сиде микРОГ 1 узкрькОВ инсу 2 сн "ног . го 1. Пс творя. Такие микропузырьки с , .,рукт в коппоидальном "0О. и и органическом растворите, , )Кгщтем иэбытск растворенно,0 .Ррхо.т;о-активного вещества, 3-.1 с.г аничесткий раствор подая , гр и к кслбу, содержящуо 30 мгс; .-;одного 1 яСь концентра- Стс,:.смесь эмульсифицируют01 ощью эмульсифицирую;1.-11 КРИ.:;5 сц, РЯЩЯЮЩЕЙСЯ С ВЫСОКОЙи .с г, ,осте этои стадии смесь мор,; " ТР;,;-,ть ДиспеРсию мелких ка, , г-О)", "Яи Ч Р. С К 0 Г 0 Г а С Т В 0 Р И ТЕЛ Я Н с,". й Фазе, 1 я)сдяя капля в диспер- СИИ ОЛ:РК. Т СПИСЯННЫЕ ЛИПОСОМНЫЕ и-, с- очес "вс 5 Ники и избыток липидов.г)1;.,К 7 трубки поток воздуха ,:.,Яг) ;Н;,"ТРЬ г" Опб И ПРОП,ГСКЯ)ОТе) сх 11 ко к говерхости -мульсии"И -РР 31.-.:;И)ан 133 ПРИ 30 Ср СМЕСЬ .о, сг:гя и аров растворителя охлаж 7707 51 сондРНСЯТОРР ПРИ 10 С В РЕ 5),с 1:. Р чего пари конденсируются)ю;,тко-г.л, Зту операТио продолжа- ПГ,;С ТЕХ ПОР, ПОКЯ НЕ ПРЕКРаГИТСЯ со:.с. 1, .:.С.я (примерно 20-30 мин) ..0 .,с этой стадии в колбе остается гс 1 с.рно 20 мл прозрачного раств ор а ( с .- Гт сЯС ,) . 45 2 Г лцпосомного раствора подг)ергяют х)оматографированпо на кос) нке содержащей 2, 5 г Сефадекса С(э)юект Ор 15 Ч водный МяСр 0,05 1 фосфатный буфер, РН 7 р 5),55 Пр; аяялнзе (спектрометрцческом) элюата уста;овлено, что только 20-257 пер окрчального инсулинового раствора иэбР ает инка)с.улирсяни 1, .О:)то 1, в б 01131 с твс слУЯР г 105 УНР и п 1 И 1 п 0сомп 1: раствор мо)кно торпетиес -К 1 С ПО)ЗОЯТ В 7 См 3311 Р р К ЯК гНпг;7 РН б;,ос игс.;0 Нс тки,:)иОГПкозиляэ 1 С Г /:1 33 слегГиукт3, С.5ряствоге кяС спс)дую:;и; образом, Сме,.ь 77 Мг пеТптпня, 0,1 3:ами)сэг 5 к)коз 17 яного ряс Г Гс 1 я и3 мл диизопропилового эфира ПОГс р Г то т о б р Я б с) т с с угг р Я з в у с 0;3тРс.11 2 3711 (2 311 1, 15 Г З 7) Г 1 Гиохпяж с нии нижс 30 С с пово;3 юОх)1,жляюгс 3 бЯ 1 ц, Псчуяк)т и;)Озряч -ук Омогеннук Губо:1 тук) к.;кос т,:с котсрой лоб,ня т 5 1;: 0,15ОхНОГО 7 ГСД . Смс: э.ьссПр 7 гК ЯК 0.ИСЯНС 7 В П 71111 РСПО Р Е ГС)ТОКУО М 5301 П) ГРО 1)ЯЮТ ГОТОСОМазОтя, кОторкЙ ныпяри)яет Оргя 11 -чРский рс 1 ст 01)ите)1 ьЭту 1 рс)ду)купродопжаот по тех поп поня пепрекратится ис 35 р 13 ( 20-30 мп)1) .Получают прозраИую суслзо ко:,3;Оиляпьпх .Ипосо 3 сл 0 О, .) ".ряст)ОР яС 0СОГРРс;пс 3 ОчНбоГ 13 с.с кО;ичс)ст 30 с 3)Н 1 р 10:,ПЕЗЯХ)ЯЧЕННОГО ФР)1 ПТЯ,В зависимости 07 1 язнячс)пинГ) Я С Т 3 0 Р М ОЖ Е 0 И С 310) 1 Ь 3 О Я ТС 1 К П 0с Рб либо Госипе О . тгч 1 Н 51 пссс;,и -РОВЯННОТ,ЯМИ)ГПОСОЗНГТЗ 1 (НЯПРЦмРР посредство,1 Ген хромя 1 ОРяфииня Сефядексе),П р и м е р 3, По)торяох способПО ПРИМи)Ъ 1 Но 1 С03 , И, Б С Я(0,1 моль), диспергирующяя средаводный 0,15сЯС р поверхност оактивное вещество - лецитин 105 мг,холестерин 35 мг, раствортельбутилацетат 3 мл,П р и м е р 5. Повторяют сгтособ по примеру 1, но исгочьзуют следующие ингредиенты: для инкяпсулиродзлця - бтле дчдэсддд коцентрлцдМ 1/31 ед с 1 ам гдинлтгддйфосфате (0,05 31), диспергирудпля Фаза нодцьп 0,15 1 ИЯС; лпид - лепитн 85 м и Фосфятиди 1-этяцалямие 45 МГ; растворитель 3-гептацан 3 мл,П р и м е р 6. Повторяют способ по прперу 1, используя в качестве ингредиецтов следукпяие вепестдзл: 0,1 ".11 Водного рястгзорл кислотного есопзедссл по:иицозиновой - полцтиддшовой ксот (годе,) - гдоли (с) концетрлции 1 мг/мл - лля ицклпсули. рованя; диспергцруеопдля Фаза 0,15 Г ЯС; павгдхнастна-активнсзе еество - лецитин 60 мг, стелриллмиц 20 мг и холестерин 15 мг, рлстЭаритель - смесь 1;1 пс, Объему дик:зоп 1 дапилОБОГО простОГО сддиЭа и бутезЯдтатя 3 мл. 10 15 20 П р и м е р 8 1 г трипсна в 30 мл О, Г (р 11 7) Фосфатного Гуфера обрлбатыгдают ультразвуком в пр- сутствци раствора 30 г Фосфлтдилкцозитола в 100 мл ддпропизОвогсд про стого эфира. Затем добаляот 460 мл Водного 0,5%-ного оЯС ировс пят эмул ьсисддицкЭ 013 лнде е Танкуо дмуе ьсию выпарвают г, течение 3 ч прк 15 С под длдззецдем 10 торр, псзлучля 55результате прозрл ный липосамный растворПосредством адазза Образца (хроматография нл Гефалексе С),П р и м е р 7. К 20 мл дииэопрапиловога простого эфира Лсэбавзяю 1 1,5 г лецитина, 0,4 г фсэссЬедтдддгдсе - рина и 0,5 г холестериня, затем раствор 1,8 мг актицамкшца ) 3 мл Фосфлтного буфера (0,1 Г 1, рП 7). Смесь подВерГают )льтгдазвуковай Обработке В течение 5 мин, кяк описано В гримре 1. Затем добав:евог 100 мл30 Езодцого сдоссяногэ буфера (0,1 31 7 ) и .3ус 1 сифи 1 ц 1 р О В липе ссуп ст - впдпот так ддсс, как В пример 1. с останлвзкдвля эмульсифицирущей мепалк, кс)здбу прдсолиняот к вакуумной лодзупк к дяление пос тепенно уменьплдот до 10 тсдрр гдри одновремецномс поддердкадпш температуры 20-22 С. Посзде пркмрд:о 45 миц щиз Опропдздсэ г ПЭОСТОЙ:ЭФИР ПОЗОСТЬЮ ОТГОЕ 1 ЯРТСЯ, Остаточная смесь по;у ается и Виде40 праядачного з;пасомного рлст ор л. Посредствам хромлтогрлфи образца цл Сеавалессе цлйдецо, чта захвачена 88% перзоцячадд ного лктицо нщинл 3) уста НО:1 ео "дто Вых Ог 11 кл пс ч д Пав Ванд:л составляет прдегддзсд 85,П рм е р 9. К 3 мп дибут.аВс 1 го простсзго эфдзря добавляют О, 131 Волпого рлствсдрл 3, 9-бксдиметцллмНО- сЬрцлзотодддйхзОрдл концетрапиО 001 Л 11 0 1 д Г ЯГР.)31 Ед.иплльмитоие 1-фг сфят липхолцнл. 8 ятемсм сь оЕвер пот у:дьтрязвуковомуВоэдействдгю, клк опсяца в прмере 1,и ПО;1)чл от 1 раз 1 езчн 1131 сэдрдЯдЭс к 13р астгзср, с одердклпдш мик ропузырькд( ГШПОСаЕЕЦЫВ ПР ЕДППЕСт ВЕ ННИКИ) УКаЗацного окр;дпде 3 аго одного раствора, окруженные слоем диплльмитоил-фас. - Флткдилхалицл. Органический рлстор после этого центркфугируют в те.ц,ше 20 мц при 8000. По оканчлнэтой стадии полуЯот прозрачную поверхност ную ФаЭ и псдд пэозрлччо Голубъкд донн оо фазу, содрддсяпую мккропузырь- К И, 3 ТФЛ 3 У, Г 1 ЮПД 10 К 0 Ц С 13 С Т Р Ц ПЮ геля, прецосят в 10-мил.пметродз:й резервуар, гдее ереме;пинают с памап;ью опятля с 0,3 мл 00 г/мл ряст 33 огдя, (.ц 10:ягде 10 саатноп 111 е 20: 1) СТЕС .ДГ 1 С 1 гдТД;НЯ ФОССДЛГДПДЗДГГДД - дел В .1 бгп изодом тдрострм эфдрез тем к Г гстсэд млсг дсэблг,ляют 5 м 1 0 ", , 3 э "3;301 р;эяссгд;Овл ЯС 0 дп с еес е, по 1 В 13 лю 1 1 то синаму и сзэ емсп за Ипо магнит:.Ой мсчалкой, Чрз 10 1 д м дц и 011 л ю т Г Р и О Г Р н ц ы й д 33 а ч р яцый рлс гор, содердкяепкй в суспензк 111 и Рсое 1 ы с.0 ам 1 п л:1 ым 1 абазЭк лм Яру,;"не"1 с;ай этой о. алодз состодт Кз СМЕС ЭГГ;ЕЦЕГГДШЛФОСНДЛТДГЗСЗ- д)11 НЕ Л РС ЕЗЦУТДСЦНй СГД СОС Та 1 1 з ддя.ьм 110131 заф 3 т,Г 1 хал 13 1: р м е р 10.;1 ш;осомцыс. роз.псс гснцки, согержсзпие инсулин, ПОЗУчЛ, т таК СЕ, КЯК ОПИСаца В ПРМЕ ре 1, Зятем вместо цепасредствеццо - го эмулдсфидшрования органическогорасторл, садердслПего микропузырькиво,.ам С,9.,-ддае Паствад ЯС", органический раствор сначала концнтрирудот, подвергая поедздгедному даеззенио (20 торр) при комнатной температуре, После выпаривадшя органических растворителей на дне резервуараа получают маслянистьп г олупддалр ач 1 ый сгдо 3 состоядпид из слип пихсд хшкропузырьсав. Все это добавляют в колбу сМл водного раствора 0,9%-ного РЯС и с помопью магдтеОЙ меепя 1 ки эту 1 асздяд 1 студО Фазу диспергируют в водной сред,Заказ 3396/57 Тираж 722 Подписное ВПИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений ч откргтий 113035, Госквя, И, Раушская наб д, 4/.5Фиттиатт ПП 1 "Патент , г, Ужгород, утт, Проектая, 4 Эта масляистая Фаза постепенно исчезает и через 10-15 миц получаютпрозрачный гомогецный раствор, содержащий в сусцензии нужные липосомы, После хроматографировация этогораствора на Сефадексе 4 В Р 1 тапоаст.а Втгестеп) анализ некапсулировацойФазы показывает, что 52% исходногоинсулина эффективно инкапсулировацов липосомах,П р и м е р 1. Смесь лецитина40 г, дибутилового простого эфираб 00 мл и водного 0,9%-ного раствораМаС 1, содержащего 10 г/л инсулина,400 мл, гомогенизируют с помощью гомогенизатора Г 1 ТГ 1 Т КОГ 1 ТС (1 Тт:газои сз сс 1,0 геа Вт. татп),Потутаот ста -бильный молочнообразый раствор,который наливаот в 4-литровую колбу,содержашую 2 л водого 0,9%-огораствора гаСт, Затем с по:гощьюэмульсифиттирутотгтетт меггалктт орг ацическую суспензию и воднуто среду эмульсифицируют вместе 15 миц. После этогоорганический растворитель удаляютпродувкой воздуха, т.е, смесь циркулирует вниз в колонке противогтоттожтто от он. подимаго цегос воздуха, Пос,тедггий собирают, после тассьттгетгияпарами растворителя, тт верхей частитсоттснки, Таким обрззом получагот гомогеццьгй полупрозрачьтй раствор П р и м е р 12, ибутиловый простой эфир Э мл, водный 9%-ный растттор АСт., содержащий 10 мг(мтт ттггутттгтта, 1 мл и лецитин 125 мг по ещатот В проч етю 1 О-мттлттиттитр одуо Йттрексовую пробирку вместе с 2 г стеклян. ных ш:пиков диаметром 1 мм,Пробирку закрывают, помещают ца мешалку и трясут в течение 30 миц со скоростью100 об/гттттт, Таким образом получаютдотольто гомогецный молочцообразцый раствор, который выливают в100-.тилилитровую колбу, содержащую30 гттт водного 9%-цого раствора тйС.Затем органический растворитель выттаривают, как описано в примере 2,ттсгтолт.зуя поток азота. После продувки в течение 20-30 мпн получаютцтцдный раствор липосом, содержащих инкапсулированный инсулин,