Субстрат для закрепления бактерий и способ хранения неспорообразующих бактерий рода

(5 С 12 Н .1/04 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСВВУ СССР79,сйодегоскгда.- У 9,ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТ(71) Одесский ордена Трудового Красного Знамени государственный университет им. И.И.Мечникова(56) 1, Методы хранения коллекционных культур микроорганизмов. М., "Наука", 1967, с. 141-144.2. Авторское свидетельство по заявке 9 2781918/28-13, 193. 1 цчеп В.1. А з 1 шр 1 е ще Гог 1 опЕСегш ргезегчай 1 оп оГ сц 1 гцгез оГ 1 асй 1 с асдй Ьасйе ".Арр 1. Васгег 1 о 1", 1979, 47 р. 379-381.(54) СУБСТРАТ ДЛЯ ЗАКРЕПЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ И СПОСОБ ХРАНЕНИЯ НЕСПОРООБРАЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ РОДА РЯЕШ)ОМОМАБ. (57) 1. Субстрат для закрепления бактерий, содержащий песок, о т л ич аю щ и й с я тем, что, с целью удлинения сроков хранения неспорообразующих бактерий рода Рзецдошопаз, субстрат дополнительно содержит рыбную муку при соотношении компонентов, об.Х: рыбная мука 80-85; песок 15-20.2. Способ хранения неснорообразующих бактерий рода Рзецдошопаз, предусматривающий адсорбцию бактерий в дисперсном субстрате, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа и удлинения сроков сохранения биохимической активности бактерий рода Рзецдошопаз, адсорбцию осуществляют в процессе культивирования бактерий с субстратом, в качестве которого используют смесь рыб- Е ной муки с песком, взятых в соотношении 41-5,7:1, внесенную в среду в количестве 10 об,7 с последующим С отделением адсорбированной биомассы, промыванием ее стерильным физиологи ческим раствором и помещением в стерильный 0,8-1,0 Ж-ный раствор хлористого натрия при соотношении биомассы и раствора 1:8-1:10.Изобретение относится к микробно"логни и методам храпения микроорганизмов, прецназначенньм для очисткизагрязненньм воц.Известен субстрат для закрепления спор актиномицетов, содержащийпесок в смеси с почвой Я ,Недостатком указанного субстратаявляется то, что он предназначендля хранения спор и не пригоден дляадсорбции клеток неспорообраэующихбактерий, например роца Рзецйошопазбез предварительной лиофилизации,аИзвестен также субстрат для закрепления спаровых бактерий ТЬ 1 оЬас 1.1.1 цз ЙеггоохаЙапз, содержащий песок всмеси с пиритом Ц ,Однако известный субстрат не пригоден для хранения неспорообразующих 20бактерий.Цель изобретения - удлинение сро"ков хранения неспорообразующих бактерий рода Ргеийонопаз,Поставленная цель достигается 25тем, что субстрат для закреплениябактерий, содержащий песок, дополнительно содержит рыбную муку при соотношении компонентов, об.7.: рыбнаямука 80-85; песок 15-20.30Известен также способ хранениянеспорообразующих бактерий, предусматривающий адсорбцию микроорганизмоввдисперсном субстрате, согласно которому лиофилиэированные клетки бакте 35рий адсорбируют на гранулах пемзы ЗД .К недостаткам известного способаследует отнести необходимость использования специальной дорогостоящейаппаратуры для лиофилизации культурбактерий, для некоторых культур хранение в лиофилизированном состояниииа гранулах пемзы не превышает 6 мес.,что недостаточно.Цель изобретения - упрощение способа и удлинение сроков сохранениябиохимической активности неспорообра.зующих бактерий рода Ряецдошопаз.Поставленная цель достигаетсятем, что согласно способу хранения50неспорообразующих бактерий рода РяецЙошопаз,предусматривающему адсорбцию бактерий в дисперсном субстрате,абсорбцию осуществляют в процессекультивирования бактерий с субстратом, в качестве которого используютсмесь рыбной муки с песком, взятыхв соотношении 4:1-5,7:1, внесенную в срецу в количестве 10 об,7 с последующим отделением адсорбированнойбиомассы, промыванием ее стерильнымфизиологическим раствором и помещением в стерильный 0,8-1,07.-ный раствор хлористого натрия при соотношении биомассы и раствора 1:8-1;10.П р и м е р 1. Осуществляют закрепление на субстрате и хранениештамма бактрий деструкторов Ря.аегид 1 пояа КМ, способных разрушать органические красители, и предназначенныедля очистки сточных вод высокой цвет"ности,В качестве субстрата для закрепления бактерий применяют рыбную муку,промытую в течение суток проточнойводой и прокаленную при 200. С в течение 4 ч. Обработанная таким образоммука представляет собой порошок коричневого цвета. Для предупреждениякомкования муку смешивают с песком,который подвергают аналогичной предварительной обработке. Песок и рыбную муку смешивают при следующем соотношении компонентов, об.7; мука 80;песок 20. Для одного опыта берут40 см муки и 10 см песка.Суточную агаровую культуру бактерий в дозе 500 млн клеток/мл вносятв минеральную среду Мследующегосостава: калий фосфорнокислый однозамещенный 3,0 г; натрий фосфорнокислый двуэамещенный 6,0; натрийхлористый 5,0.; аммоний хлористый1,0 гф,вода дистиллированная 1000 мл,рН среды устанавливают добавлением107,-ного, раствора кальция гидрата.В минеральную среду дополнительно вносят субстрат для окисления -краситель кислотный черный С в концентрации 25 мг/л. Субстрат для адсорбции бактерий вносят в минеральную среду указанного состава в количестве 10 об.7, т.е. к 300 см средыдобавляют 30 см субстрата. Адсорбцию культуры на субстрате осуществляют в процессе культивирования в течение 48 ч при 30 оС, Затем закрепленные на субстрате клетки бактерий отмывают дважды стерильным физиологическим раствором, после чего субстрат с закрепленными клетками переносят в 8 пробирок размером 25 х х 1,5 см в количестве 3 см и заливают 24 см стерильного 0,87-ного раствора хлорида натрия (объемные соотношения субстрата и раствора310931:8). Культуру хранят при 4 С и прикомнатной температуре, По истеченииопределенных сроков хранения (6,9,12и 24 мес изучают жизнеспособностьи деструктивную активность штамма Рз.аегцу.поза,Проверку жизнеспособности и деструктивной активности бактерий послехранения в условиях периодическогокультивирования осуществляют следую Ощим образом.Для реизоляции бактерий послехранения субстрат с закрепленнымиклетками промывают 3 раза стерильнымфизиологическим раствором, растирают 15в стерильной ступке, а затем используют как инокулят при посеве в минеральную среду М, После культивиро-,вания в течение 48 ч при 30 С про-.оводят рассев на поверхность мясо Опептонного агара в чашках Петри длявыделения чистой культуры..Припроверке окислительной (деструктивной) активности бактерий используют суточную агаровую культуру, 25которую в дозе 500 млн клеток/мл вносят в минеральную среду М, содержащур загрязняющее вещество - краситель кислотный черный С в концентрации 100 мг/л.ЗОМикробиологическое окисление осуществляют в процессе периодическогокультивирования при 30 С в течениеО48 ч в стационарных условиях.Результаты деструкции учитывают 35 методом фотоэлектроколориметрии на фЭКпри Я = 750-760 мм (красный светофильтр) после осаждения микробных клеток центрифугированием при 4 тыс. об/мин в течение 8 мин. 4 ОКультура бактерий Рз. аегц 8 поза после 6,9,12 и 24 мес,хранения независимо от температурного режима сохраняет способность к росту в минеральной среде Ми вызывает 98-10045 деструкцию красителя кислотного чер- ного С (таблица).П р и м е р 2. Осуществляют закрепление на субстрате и хранение штамма-бактерий деструкторов Рз.Ицо 50 гезсепз.2", Обработку рыбной муки и песка осуществляют как указано в примере 1.Муку и песок смешивают при следую. щем соотношении компонентов, об. : 55 мука 85; песок 15. Для опыта берут 43 см муки и 8 смз песка. Суточную агаровую культуру бактерий в дозе 698 4500 млн клеток/мл вносят в минеральную среду М, в которую дополнитель.но вводят субстрат для окисления -краситель кислотный черный С в концентрации 75 мг/л, Адсорбцию культуры на субстрате осуществляют как указано в примере 1. Хранение осуществляют в 8 пробирках под слоем стериль.ного 1,07-ного раствора хлорида натрия при объемном соотношении субстрата и раствора 1;1 О (Зсм субстратазаливают 30 см раствора хлорида натрия), при 4 С и при комнатной темпеОратуре,По истечении определенных сроковхранения (6,9,12 и 24 мес) изучаютжизнеспоосбность и деструктивнуюактивность штамма Рз.Г 1 ц 1 гезсепз 2как указано в.примере 1 (загрязйитель - краситель кислотный черный Св концентрации 75 мг/л) .Культура бактерий Рз.1 цогезсепз 2после 6,9,12 и 24 мес,хранения независимо от температурного режимасохраняет способность к росту в мине.ральной среде Ми вызывает 90-100 деструкцию красителя кислотного черного С в концентрации 75 мг/л (таблица),П р и м е р 3. Осуществляютзакрепление на субстрате и хранениештамма бактерий - деструкторов .Рз.зресдез 6,предназначенных для очисткиот формальдегида сточных вод химических производств.Обработку рыбной муки и песка осуществляют, как в примере 1. Муку и песок смешивают при следующем соотношении компонентов, об. : мука 82,5;песок 17,5. Для опыта берут 41 см муки и 9 см песка.Суточную агаровую культуру бактерий в дозе 50 млн клеток/млвносят в минеральную среду М, в ко.торую дополнительно вводят субстрат для окисления - формальдегид в концентрации 100 мг/л. Адсорбцию культу.ры на субстрате осуществляют как ука.зано в примереХранение осуществляют в пробирках под слоем стерильного 1,0 .-ного раствора хлорида натрия при объемном соотношении субстрата и раствора 1:9 (3 см субстрата и 27 см раствораахлорида натрия), при 4 С и при комнатной температуре.По истечении определенных сроковхранения аналогично изучают жиэне1093698 Субстрат длладс орбциимикроорганизмов, обЛ: Условие вдсорбииикикрооргаяизковва субстрате акойиостис,трата клорватНолово- Нолокобактериир.1.восо"аовсоср.1 ассоЬас 111 цар.Зсгер- сососсца реда арителвваелиофилиз алиеиикроорге низкое р.Асс 1 ооаеусев(саорм).,Сквсв ио- ви с авар" левик ивскои То 48-6 Иредлагабсией Вактериидеструкторир.рвеи 4 оаоааа ука В Песок 20аеси 81 в див Краситель квслотвмВервий С100 Юрасйтелв кислот вийервзй С75Иоогеиа 2 е Песок 1 1:10 25Ц 3 а.зрес 1 е Форкалвдегид акаэ 3377/22 Тираж 522 Подписное атеитк, г.уагоро уд.Проектнае, 4 способность бактерий и деструкцию формальдегида в концентрации 500 мг/л колориметрическим методом с применением хромотроповой кислоты.Штамм Рй.зресхеа 6 после 6,9, 12 5 и 24 мес.хранения независимо от температурного режима сохраняет способность к росту в минеральной среде И"9 и вызывает 95-1007 деструкцию формальдегида (таблица), 10Таким образом, после 24 мес.хранения предлагаемый способом на новом субстрате бактерии сохраняют высокую окислительную активность, что позволяет использовать их для микробной 15 очистки водной среды от токсикантовзагрязнителей после длительного хране ния.Предлагаемое изобретение упрощает процесс хранения микроорганизмов,Возможность .использования бактерий для микробной очистки водной среды от токсикантов-загрязнителей после длительного хранения обусловли. вает экологический эффект в аспекте борьбы за охрану окружающей среды,Таким образом, реализация изобретения позволяет длительно хранить неспорообразующие бактерии рода Рвец йошопаз, используя упрощенный способ хранения, и обеспечить сохранение их биохимической активности.