Способ определения нейротропной активности веществ

О П И С А Н И Е ( )996910ИЗЬБРЕТЕН ИЯ Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУпв делам кзебретеккй и еткрытий. Н. Соколов,ахаровпо биологиий орденаударственнмоносова Научно-исследовательский институт химических соединений и Московск Трудового Красного Знамени гос им. М. В. Ло(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕЙРОТРОПНОЙ АКТИВНОСТ ВЕШЕСТВочносссле оИзобретение относится к области выявления свойств веществ, а именно к выявлению нейротропной биологической активности и может быть использовано в медицинской и фармацевтической промышленности для массовых первичных испытаний веществ на биологическую активность.Известен способ определения нейротропной активности веществ путем идентификации нейронов беспозвоночных 11 .Однако известный способ не обеспечивает высокой точности. Известен также способ определения нейротропной активности веществ, заключающийся в том, что белым мышам внутрибрюшинно вводят испытуемые вещества в логарифмически возрастающих дозах (10, 20, 40, 80, 160 мг/кг и т. д.) и наблюдают за поведением животных 2 .Недостатком этого способа являются большие экономические затраты на выявление одного вещества, обладающего нейротропной активностью, вследствие большого расхода животных на испытание каждого вещества для получения достоверных результатов; невозможность полной автоматизации эксперимента, что приводит к низкой производительности способа, а также субьективность получаемых визуальным путем данных и косвенность оценки нейротропной активности вещества вследствие того, что регистрируются лишь изменения поведения животных без регистрации электрической активности мозга. Цель изобретения - повышение тти способа и ускорение проведения и д 1 оЭвани и.Цель достигается тем, что способу определения нейротропной активности веществ путем воздействия ими на биологический объект, в качестве биологического объекта используют виноградную улитку, при этом вещество растворяют в растворе Рингера и вводят"в мозг улитки, анейротропную активность определяют по регистрации электрическихх параметров нейронов.Способ осуществляют следующим образом.Центральную нервную систему улиткивыделяют и помещают в ванночку с постоянным протоком раствора Рингера для холоднокровных животных. Соединительно996910 20 3тканную оболочку ганглиев удаляют, ванночку помещают в экранированную камеру и под визуальным контролем в идентифицированные нейроны вводятся стеклянные микропипетки, укрепленные на микро- манипуляторе типа ММ, соединенные через подводящий агаровый мостик и неиоляризующиеся хлор-серебряные электроды с регистрирующим устройством, связанным с электронно-вычислительной машиной, обрабатывающей данные непосредственно в эксперименте. При этом регистрируются частота потенциалов действия, потенциал . покоя, возбудимость на внутриклеточное раздражение, вызванный ответ на ортодромную стимуляцию, действие на искусственную патологию нервной клетки, Возможна также регистрация сопротивления мембраны, реакции на аппликацию определенных медиаторов, пейсмеккерной активности ири необходимости углубленного изучения действия вещества. Все параметры регистрируют до воздействия веществом, во время иерфузии раствором испытуемого вещества и при отмывании через регулярные интервалы времени; они отражают динамику возникновения эффекта вещества и его исчезновения при отмывании. В случае стабильного эффекта берется средняя величина.Концентрация веществ варьируется ступенчато от 1 О М до 10 д М. Концентрации веществ больше 10 2 М не исследуют, так как эффект достигается не специфическим физиологическим действием исследуемого З 0 вещества, а его концентрационным действием,Все параметры регистрируют одновременно на четырех типах нейронов, описан-ных выше, так как при перфузии вещество действует на все нейроны одновременно.Оценку действия вещества производят либо ио изменению параметров при действии вещества, либо ио сопоставлению регистрируемых параметров с действием иа те же параметры применяющихся в клинике 40 лекарственных средств, механизм действия которых уже известен.Время эксперимента ио испытанию одного вещества составляет 2 - -4 ч в зависимости от особенностей исследуемого вещества. 41Вследствие хорошей воспроизводимости результатов, полученных на одних и тех же нейронах, для оценки нейротропной активности одного вещества достаточно двух опытов, т. е. восемь отведений активности нейронов у двух улиток, тогда как достоверные результаты в известном сиособепрототипе могут быть получены только ири проведении 5 - 10 экспериментов, что требует затраты около 20 животных.Пример. Раковину половозрелой вино градной улитки разбивают, извлекают центральную нервную систему и закрепляют ее в ванночке с восковым дном, в которой находится раствор Рингера для холоднокровных имеющий состав, мМ:1 хаС 1 80; КС 4, СаС 7, МдСг 5, Трис 5, рН 7,4. Соединительнотканную оболочку снимают с поверхности подглоточного комплекса ганглиев.Интестинальный и правый паллиальный нервы накладывают на хлор-серебряные биполярные электроды, соединенные со стимулятором ЭСЛдля нанесения транссинаитического раздражения.Стеклянные микропипетки с диаметром кончика менее 0,5 мкм, сопротивлением 10 - 40 Ом, заполненные 2 М раствором цитрата калия, которые соединяются через агаровый мостик и неполяризующиеся хлор-серебряные конта кты со входом усилителя, вводят в нейроны. При этом автоматически начинается регистрация фоновой активности всех нейронов (частота спонтанных потенциалов действия и потенциал покоя) .Перфузионная система, соединенная с ванночкой, обеспечивает постоянный проток через нее раствора Рингера.Через 2 мин после начала регистрации на каждый нейрон через мостовую схему подают постоянный деполяризующий ток длительностью 5 с, а спустя 5 мин прикладывают напряжение 1 в течение 0,1 с на хлор-серебряные электроды (при этом регистрируют частоту потенциалов действия на внутриклеточное раздражение и вызванные потенциалы на транссинаитическое раздражение), после чего переключают иерфузионную систему на раствор Рингера, содержащий натриевую соль дифенил гида нтоина в концентрации 10 4 М, при непрерывной регистрации электрических параметров - частоты спонтанных потенциалов действия и потенциала покоя.Через О мин после переключения иерфузионной системы на каждый нейрон подают постоянный деиоляризующий ток длительностью 5 с, а через 13 мин на хлор- серебряные электроды прикладывают напряжение 1 ч в течение 0,1 с, При этих операциях регистрируют соответственно частоту потенциалов действия на внутри- клеточное раздражение и вызванные потенциалы на транссинаптическое раздражение.Через 15 мин переключают систему на чистый раствор Рингера, перфузию которым продолжают до возвращения параметров в первоначальное состояние, после чего перфузионную систему переключают на раствор Рингера, содержащий коразол в концентрации 0,5 вес. %, и регистрируют судорожные разряды. Через 5 мин после смены раствора через ячейку пропускают раствор Рингера, содержащий 0,5 вес. % коразола и 10 4 М натриевой соли лифенилгидантоина.Затем, продолжая непрерывную регистрацию, поочередно через каждые 15 мин осуществляют аналогичные операции, ме996910 Составитель С. Малютина Техред И. Верес Корректор Г. Решетник Тираж 871 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д, 4/5 Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4няя лишь концентрацию исследуемого вещества (5 10 4 и 10 з М).Предложенный способ позволяет повысить производительность в результате полной автоматизации эксперимента, а также точность, сократить экономические затраты более чем в 30 раз и ускорить проведение исследований. Формула изобретения1 ОСпособ определения нейротропной активности веществ путем воздействия ими на биологический объект, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа и ускорения проведения исследований, в качестве биологического объекта используют виноградную улитку, при этом вещество растворяют в растворе Рингера и вводят в мозг улитки, а нейротропную активность определяют по регистрации электрических параметров нейронов.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе 1. Капде Е. й. СеЦи 8 аг Ьаз 1 з о 1 ве 11 ач 1 ог.5 ап, Гг, Ггеегпап, 1976, р. 11 - 16.2. Раевский К. С. Фармакология нейролептиков. М., Медицина, 196, с. 83 - 99.