Способ изготовления ферментного электрода

11958950 ОП ИСАНИЕИЗЬВРЕТЕН ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоветскихСоциалистическихРеспублик(53) УДК 543,257 (088,8) нв делам нзебретеннй н еткрмтий(72) Авторы изобретен Ленинградский медицинский институт им. ак сесоюзный научно-исследовательский конструмедицинской лабораторной техн(54) СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ЭЛЕКТР 1Изобретение относится к аналитической химии, в частности к способам получения ферментных кислородных электродов, применяемых для измерения концентрации глюкозы в биологических средах, и может быть использовано в химической и медицинской промышленностях.Практически все известные гель-фермент. ные электроды приготовлены иммобилизацией ферментов в геле полиакриламида. Различия заключаются лишь в том, какой метод полимеризации (химический или фото- инициируемый) используется при приготовлении гель-фермента.Преимущества полиакриламидных гелей состоят в том, что образующийся полимер легко гранулировать и в зависимости от условий реакции можно получать гели различной пористости.Известен способ получения ферментного электрода путем захвата фермента между поверхностью .электрода и диализной пленкой, задерживающей фермент для молекул субстрата и продукта 1.Недостатком способа, является очень быстрая потеря активности электрода при эксплуатации и хранении в буферном растворе из-за диффузии фермента из геля в раствор и требуется дополнительная стадия закрепления на поверхности электрода полиакриламидного геля, содержащегО фермент,Наиболее близким техническим решениемк изобретению является способ получения ферментного электрода, заключающийся в растворении в воде акриламида, Х,Х-метилен-бис-акриламида и фермента и проведео ния процесса полимеризации 2. Известный способ осуществляется следующим образом, Растворяют в воде акриламид, И,М -бисметиленакриламид и фермент. В присутствии катализатора проводят процесс полимеризации. Процесс ведут при охлаждении в течение 1 ч. Затем полученный. ,полиакриламидный гель, содержащий фермент, закрепляют на поверхности электрода различными нрсителями и пленками (целлофаном, нейлоновой сеткой, тефло новой тесьмой и т.д.).Преимуществом способа является то, что фермент относительно прочно удерживается в структуре геля. Однако при многократном958950 40 Фермент Известный способ 0,063 0,025 0,090 Свободный гельЦеллофанНитроцеллюлозаНейлон 5,5 20 11 31 0,050 0,140 применении ферментного электрода происходит уменьшение его стабильности.Однако данный способ трудоемкий исложный из-за большой продолжительности, необходимости применения катализаторов, которые в ряде случаев частично ингибируют фермент; необходимости охлажденияраствора, так как выделяющееся тепло прихимической полимеризации приводит к инактивации фермента; необходимости операциизакрепления полиакриламидного геля наповерхности электрода. Кроме того, толщина образуемого полиакриламидного геля,содержащего фермент, не является стабильной, несмотря на одинаковость технологических операций.Целью изобретения является упрощениеспособа,Поставленная цель достигается за счеттого, что, согласно способу, заключающемуся в растворении в воде акриламида,Х,М-бис-метиленакриламида и фермента ипроведении процесса полимеризации с последующим нанесением геля на поверхностьэлектрода, полимеризацию проводят одновременно электрохимически путем наложения на электрод потенциала в интервале от- 1,1 до - 1,5 В в течение 1 - 5 мин.Одновременное проведение процессов полимеризации акриламида и И,1 Ч -бис-метиленакриламида в водном растворе фермента инанесения образуемого полиакриламидногогеля, содержащего фермент, на поверхностьэлектрода, .погруженного в водный раствор,значительно упрощает способ.Проведение процесса электрохимическойполимеризации в интервале потенциалов от- 1,1 до - 1,5 В (относительно хлорсеребф ряного электрода) связано с тем, что вэтой области потенциалов фермент электрохимически устойчив (не восстанавливаетсяи не теряет своей активности), а также хорошо адсорбируется на электроде, Только в. результате адсорбции фермента на поверхности электрода он включается в полимерную пленку, образующуюся при электрохимической полимеризации. В то же время при Предлагаемый способ потенциалах более отрицательных, чем,5 В происходит электрохимическое восстановление фермента и потеря его активности. В этом случае восстановление фермента на электроде мешает образованию активных 5 центров полимеризации и полимерная пленка не образуется. При потенциалах менее отрицательных, чем - 1,1 В, не происходит образования инициаторов полимеризации и полимерная пленка не получается.Предлагаемый способ получения ферментного электрода состоит в следующем. Растворяют акриламид, 1 Ч,И -бис-метиленакриламид и фермент в воде. В полученный раствор опускают металлический электрод. Подают на электрод потенциал в интервале 5 от - 1,1 до - 1,5 В относительно хлорсеребряного электрода, при котором в течение 1 - 5 мин на поверхности электрода в результате электрохимического инициирования процесса полимеризации образуется полиакриламидный гель, содержащий фермент.Пример. 11 риготовляют водный раствор,содержащий, г/л: акриламид 300; И,М-бисметиленакриламид 20; хлорид цинка 25; глюкозооксидаза 0,4. Металлический электрод обезжиривают, промывают водой и погру жают в данный раствор. Задают электродукатодный потенциал - 1,1 В относительно хлорсеребряного электрода и ведут электро- химическую полимеризацию в течение 2 мин, Вспомогательный электрод из алюминия, Температура процесса составляет 20 - 25 С. З 0 Толщина образуемого полиакриламидногогеля 20 мкм.Ферментный электрод, получений поданному способу, и электрод, полученный по известному способу, исследуют на актив ность спектрофотометрически на прибореСФ - 4. Определение активности основывается на измерении УФ-спектра комплекса КЯ ( Л = 353 нм), образующегося в результате взаимодействия К с НО (продукта окисления глюкозы под действйем глюкозооксидазы),Результаты активности приведены в таблице. 1 Относительная пОГло- активность щения фермента,Ъ958950 Формула изобретения Составитель И. РогальРедактор М, Дылын . Техред А. Бойкас Корректор Г. ОгарЗаказ 6765/59 Тираж 887 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Исследования показывают, что ферментный электрод, полученный по предлагаемому способу, обладает значительно лучшей активностью, чем по известному способу на самых различных носителях,Предлагаемый способ получения фермент ного электрода по сравнению с известным проще и доступнее, так какпроцесс использует электрохимические приемы, проводится быстро (в течение 1 - 5 мин) при комнатной температуре, исключая охлаждение и применение катализатора. Отсутствует операция закрепления геля на поверхности электрода, так как при электрохимическом инициировании полимеризации полиакриламидный гель, содержащий фермент, образуется непосредственно на электроде. 15Способ позволяет продолжительностью процесса регулировать толщину полиакриламидного геля и содержание в нем фермента.Активность электродов, полученных согласно предложенному способу, сохраняется при эксплуатации и хранении в течение 2 - 3 мес., что позволяет широко и эффективно применять ферментные электроды, полученные по данному способу, для определенияразличных химических соединений при ферментативном методе анализа. Способ изготовления ферментного электрода, заключающийся в растворении в воде акриламида, И,И-метилен-бис-акриламида и фермента, проведении процесса полимеризации с последующим нанесением геля на поверхность электрода, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, полимеризацию проводят электрохимически путем наложения на электрод потенциала в интервале - 1,1 - 1,5 В в течение 1 - 5 мин.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе 1. Н. %1 ззоп апд о 1 Ьег Ре 1 епп 1 пабоп о 1 дцсозе ига апд реп 1 с 1 йпе цз 1 пК епгуте- рЬ-еес 1 гойе В 1 осп 1 гп, В 1 орЬуз. Ас 1 а, 320, 529, 1973.2, Л. б, Мот 1 а 1 чо, б. б. бц 1 Ьац 11, Апа 1. СЬев. 41, 1897, 1969 (прототип).