Способ бактериологической диагностикивоспалительно нагноительных заболеванийлегких

Союз Советских Социалистических Республик(45) Дата опубликования описания 07.07.81 М, Кл.з А 61 В 10/О сударственныи комитет СССР о делам изобретенийМуромский, Д, А. Егорк вский областной ордена ени научно-исследовате институт им. М. Ф, Вл ина и К. И. СавицТрудового Красноьскчй клиническииадимирского Мос Зн(54) СПОСОБ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ВСПОМОГАТЕЛЬНОНАГ НО ИТЕЛ ЬН Ь 1 Х ЗАБОЛЕВАНИЙ ЛЕГКИХеди- биоьту био еч Изобретение относится к области цины, а именно клинической микр логии,Известен способ бактериологическо агностики воспалительно-нагноительнь болеваний легких путем посева иссл мого материала на питательную сре последующим выделением чистых ку микроорганизмов и определением их химических свойств 11.Однако известный способ не обес вает высокой точности. Целью изобретения является повышение точности диагностики.Эта цель достигается тем, что способ бактериологической диагностики воспали. тельно-нагноительных заболеваний легких осуществляют путем посева исследуемого материала на питательную среду с последующим выделением чистых культур микроорганизмов и определением биохимических свойств, у выделенных культур микроорганизмов определяют наличие лецитиназы и фосфотазы, пересевают их на пер. вичную однослойную культуру ткани пери ферических участков неизменного легкого и по наличию цитотоксического эффекта в 54,2 - 83% клеток диагносцируют воспалительно-нагноительное заболевание легких. Способ осущсствляют следующим образом.Исследуемый материал (мокрота, содержимое плевральной полости, кусочки 5 легкого, полученные при операции) высевают в чашку Петри с 5%-ным кровяным агаром, средой Эндо и Плоскирева. Через 18 ч инкубации в термостате при 37"С снимают по 8 - 10 однотипных колоний куль- И тур микроорганизмов, определяют лецитиназную и фосфотазную активности. Суспендируют чистые культуры в 1 мл 0,15 М раствора ХаС 1 (рН 7,2 - 7,4). Суспензия культур, обладающих указанными видами 15 активности, доводят 0,15 М МаС 1 по стандарту мутности до концентрации 10 кл/мл и добавляют к монослою первичной куль.туры ткани периферических участков неизменненного легкого.2 О Однослойную культуру первично дезагрегированных клеток ткани периферических участков неизмененного легкого получают следующим образом.В асептических условиях тщательно ос 25 вобождают ткань от крови, полостного со.дсржимого альвеол, бронхиол, готовят оп.тимально действующую дсзагрегпруюшую смесь веществ, разрушающую только межклеточные связи, Затем приготавливают зо питательную смесь для обработки ткани и843955 50 520 25 Зо 55 40 45 50 50 65 3культивирования клеток оптимального состава.Процесс обработки ткани и культивирования сводится к следующему,Щадяще удаляют висцеральный листок плевры. Отрезают относительно большие участки периферических отделов ткани лед. кого (4,0 Х 4,0 Х 1,0 дм), пригодныс для культивирования. Эти кусочки разрезают на более мелкие (0,5 Х 1,0 дм) в чашке Петри с теплой (37 С) питательнои смс. сью, содержащей среду 199 - 48%, гидролизат лактальбумнна 47/о, сыворотку крупного рогатого скота 5 О/о, стрептомцциц хлор-д(альцддевьдйд комплекс 300 - 500 ед/мл. Кусочки последовательно промываюг в четырех сменах вьпддсцазванной питательной смеси. С использованием лупы удаляют стенки сосудов ц бронхиол так, чтобы не повредить клетки и мембраны альвеол, со. держимое альвсолярных полостей выжима. ют, кусочки отмывают последовательно в четырех сменах питательной смеси вышеназванного состава, но не содержащей стрептомицина, Отжатые от питательной смеси кусочки ткани помещадот в инактивированную при 56 С в течение 30 мин сыворотку здоровых доноров АВ (1 Ъ) группы. Промытые в сыворотке в дечение 10 мин кусочки переносят в сухую чашку Петри, в которой ткань измельчадот до размера 0,5 - 1,0 мм и помещают в коничес. кую колбу на 500 мл с 300 мл дезагрегддрующей смеси, состоящей из следующих компонентов, /о. 0,25%-ньдй раствор трипсина 86, 0,02/о-ный раствор версена 1 О, сыворотка человека АВ (1 Ъ) группы (инак тивирована при 56 С в течение 30 мнн) 4, Кусочки ткани дсзагрегируют на магнитной мешалке при 37 С в темноте в течение одного-двух часов. Суспензию клеток про. фильтровывают через однослойный марлевый фильтр и центрифугируют в микробиологических пробирках при 800 об/мин в течение 10 мин.Насадочную жидкость сливают, осадок щадяще ресуспендируют в питательной смеси, приготовленной для культивирования и состоящей из следующих компонентов, %: среда Игла 10, среда 199, 30, гидрализат лактальбумина 30 с сывороткой крупного рогатого скота 2, сыворотка человека (получена от здоровых доноров АВ (1 Ч) группы, резус - положительная, цнактивирована при 56 С в течение 30 мин) 20, раствор глютамина в среде 199, добавленного из расчета 500 мкг/мл питательной смеси, и вновь цснтрифугируют при указан ном режиме.1-1 адосадочную жидкость удаляют, осадок ресуспендируют в необходимом объеме вышеназванной питательной смеси для культивирования, суспензию профильтровывают через двуслойный марлевый фильтр, Проводят подсчет содержания эпи 4тслиоподобных клеток в 1 мл приготовлен. цой суспензии в камере Горяева с использованием лейкоцитарного меланжера и 3/,-ного раствора уксусной кислоты с мстилсцовым синим. Клетки подсчитывают полностью в двух-четырех сетках камеры с вычислением содержания среднего количества клеток в одной сетке и с соответствующим пересчетом ца 1 мл, как цри подсчете лейкоцитов. Рабочую концентрацию клеток доводят до 2 Х 10 клеток в 1 мл. Готовую суспензию клеток разливают цо 1 мл в микробиологические пробирки равного размера (длиной 15 см, диаметром ,3 см) без покровцых стекол - для подсчета жизнеспособных клеток с витальными красителями после инкубации с микроорганизмами (стафилококки), с покровными стеклами -- для морфологических исследова ций. На каждый исследуемый штамм стафилококков и контроль выделяют по три-четыре-гдять пробирок. Пробирки стационируют в штативы под углом 6. Перед закрыванием пробирок резиновыми пробками, в случае необходимости, поверхность суспензии продувают либо газовой смесью с 5 О/о СО, либо последними порциями выдыхаемого воздуха до получения рН питательной смеси, равной 6,8. Культи. вирование проводят при 37 С в термостате с водяной рубашкой до получения монослоя клеток (14 - 21 - 28 суток), Процесс формирования монослоя культуры ткани первично дезагрегированцых клеток периферических участков легкого состоит из нескольких этапов, Смену питательной смеси проводят через 3 - 5 - 7 дней, в зависимости от изменения рН, Объем полученной суспензии клеток и количество проби. рок с одинаковым монослоем клеток к моменту цнкубации определяется количеством исследованных штаммов стафилококков,По сформировании монослоя клеток (7 - 14 - 21 - 28 сутки) в пробирки с культурой добавляют суспензию микроорганиз. мов в концентрации 109 микробных тел в 1 мл 0,15 М раствора ХаС (рН 7,2 - 7,4), по 1 мл в каждую пробирку, в контрольныс пробирки по 1 мл 0,15 М раствора ХаС с предварительным сливом 1 мл питательной смеси.Спустя один час инкубации добавляют цо 1 мл питательной среды Игла без слива суспензии стафилококков и физиологического раствора из контрольных пробирок. Спустя шесть часовинкубации содержимое пз пробирок сличают (процедура про. всдеца в термостате), осторожно наливают 3 мл 0,25% -ного раствора трипсина, подогретого до 37 С, который через минуту удаляют и добавляют новудо порцию трипсина цо 0,2 мл, с которым культуры инкубируют в термостате при периодическом встряхивании до отделения клеток от843955 аблипа Фсрмситьц характсризуюпие штаммМ /о -лоооооу - " м 69 62 50 2835 5. апгспз 128/53 8. срЫегшЫв 06/3 8. ер(1 ег)и 81 в82/7 , ер)йегги 1 пз 17 8. апгепз Контроль Заказ 4469 Изт418 Тираж 694 Подппснос Загорская типография Упрполиграфиздата Мособлисполкома 11 р и м е и а н и е: + наличие фермента- отсутствие ферментастенок пробирок и полной дезагрегации нх.К полученным в пробирках суспецзиямклеток прп комнатной температуре добавляют по 1,8 мл смеси витальных красителей, состоящей из 0,1/,-ного раствора трипанового синего в дистиллированцои водеи 0,1%-ного раствора эозина в раствореЭрла двухкратной концентрации,Краситель смешивают перед употреблением в соотношении 1: 1. Взвеси клеток скрасителем тщательно суспецдируют пипеткой Пастера, отдельной для каждои пробирки и с одинаковым сечением. Каипо суспецзии вносят в камеру Горяева. Проводят подсчет неспособных клеток в первыеминуты после добавления смеси красителей полностью в двух-четырех сетках камеры из каждой пробирки под малым увеличением микроскопа.П р и м с р. Больной Л. В культуре взята ткань неизмененных периферическихучастков рсзерцированного во время операции правого легкого бледно-розового цвета,наполненная пенистым содержимым. Тщательно и щадяще обрабатывают в теплойпитательной смеси с антибиотиками и безантибиотиков, в сыворотк человека АВ(1 Ъ) группы, удаляют стенки сосудов,бронхиол, дезагрегируют клетки ткапив течение 1,5 ч, отмывают от дезагрегирующей смеси, получают рабочую суспензиюклеток с содержанием 2 Х 10 клеток в 1 мл,разливают суспензию по 1 мл в 30 пробирок без покровных стекол, в 30 - с покровными стеклами, в 4 флакона Карреля.1-1 а 16 сутки культивированця добавляют по 1 мл суспецзии штаммов стафило.кокков, суспендированных в физиологическом растворе в концентрации 10 микробных тел после предварительного удаленияиз пробирок с культурами по 1 мл питательной смеси. Спустя один час ицкубации 6добавляют по 1 мл питательной среды Игла и продол)каот инкубацию в течение шести часов.Для подсчета с витальными красителя 5 ми в камере Горяева для каждого штаммавыделяют по 3 - 4 пробирки без покровныхстекол, а для цитоморфологических исследований - со стеклами.Распифровывают шта м мы после оконча 10 ция подсчета. Отмечают наиболее высокийцитотоксический эффект штамма прц статически достоверном различии с контролем,характеризующегося наличием гемолцзина,ленитиназы ц фосфотазы (10+ 2,52 при р(5 0,0005), а также штамма, характеризующегося наличием только лецитиназы (12 +3,76при р ( 0,0005) при показателях контроля32+. 4,97) .Прц исследовании фиксированных жид 20 костью Карнуа лиоо метанолом клееноккультур после инкубации со стафилококками и окрашенных азур-эозином, гематоксилцп-эозицом, по Граму отмечают деструктивные изменения с сильно выраженнойвакуолцзацией эндоплазии, разрушениемццтоцлазматической и ядерной мембраны,с ооразованием гранул пигмента, пикнозомяде 1) ц лизпсом клеток,Предложенный способ позволяет установить новый этиопатогенетический факторвоспалительно-цагноцтельных заболеванийлегких и тем самым повысить качество диагностики заболевания, в частности, деструктивных процессов в легки.;.35 Формула изобоетеция Способ бактериологической диагностики воспалительно-нагноительных заболева )цгй легких путем посеза исследуемого материала на питательную среду с последующим выделением чистых культур микроорганизмов и определением биохимических свойств, отличающийся тем, что, с 45 целью повышения точности диагностики,у выделенных культур микроорганизмов определяют наличие лецитиназы и фосфотазы, пересеваот их ца первичную однослойную культуру ткани периферических 50 участков неизмененного легкого и по наличию цитотоксического эффекта в 54,2 - 83% клеток диагносциру)от воспалительцо-цагцоцтсльцое заболевание легких. 55 Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Руководство по микробиологическойдиагностике инфекционных болезней, Под 60 ред. К. И. Матвеева, М., Медицина 5,1973, с, 332 - 338.