Способ витальной микроскопиинервного волокна

п) 810222 ОПИСАНИИ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ Союз СоветскиХ Социалистических Республик(43) Опубликовано О,03.81, Бю (45) Дата опубликования опис УДК 615,475тень9 я 07.03,81 йо долам изобретений и открытий, В. Ревенко, О отников и Б рдена Трудового Красного Знамени институт физиологии им. И. П, ПавловаТАЛЬНОЙ МИКРОСКОПИИ НЕРВНОГО ВОЛОКНА 4) СПОСО Изобретение относится к нейробиологиии может быть использовано при морфофи.зиологических исследованиях состояниянервного волокна.Известен способ витальной микроскопии 5нервного волокна, предусматривающийрасщепление нерва на волокна и выделениеодиночного прикрытого или неприкрытогоперехвата Ранвье 11.Однако известный способ не позволяет 10определить функциональное состояние микроскопируемого волокна,Цель изобретения - определение функционального состояния нервного волокна.Это достигается тем, что на препаратепоследовательно определяют форму луковицы и конуса и измеряют величину щели между ними, и при форме луковицы от шаровидной до полусферы и размерах щели от4 до 7 мкм определяют необратимо измененное волокно, при шаровидной формелуковицы с расщепленным конусом и размерах щели от 2 до 4 мкм определяют обратимо измененное волокно, а при шаровидной форме луковицы с нормальным конусом и размерах щели от 0,3 до 2 мкм волокно определяют как нормальное,Морфологическая характеристика изменений волокна иллюстрируется чертежом,где а - форма конусов от правильной до появления расщепления у вершины одного из конусов (зазубренность) 1=0,3 - 2 мкм; б - от зазубренности вершины до полного исчезновения одного из конусов, 1 = 2 - 4 мкм; в - от начала расслоения миелина луковицы до ее выраженного расслоения (форма от начальной шаровидной до полусферической), 1 = 4 - 7 мкм.Для удобства и облегчения определения функционального состояния волокна при витальной микроскопии необходимые параметры сведены в сопоставительную морфофизиологическую таблицу, соотнесенную с иллюстрацией морфологической картины изменений волокна (см, чертеж),Способ осуществляют следующим образом. Обычным способом изолируют седалищный нерв лягушки. Затем его помещают в раствор Рингера (температура 22 С, рН 7,3) и препарируют под лупой с попеременным расслоением и отсечением нервных пучков. Препаровку ведут сменными заточенными стальными иглами. По мере .изоляции волокна выбирают менее острые иглы.Волокно в области едва угадываемого перехвата обнажают на расстоянии 1 - 2 мм. Остальные его участки остаются в составе нервных стволиков. Из смеси воска и вазелина на покровном стекле готовят емПотенциалдействия 6 ха/6 к 6 ч 6,0,012 в ,0240,024 в ,32 19 - 5 5 - 2,7 1,6 ГенерируетНе генерируетНе генерирует 0,3 - 2 31 - 8 8 - 2,8 1,6 - 1,0 1,0 и менее2 - 4 более 0,32 и 2,8 и менее 2,7 и менее кость, залитую раствором Рингера. Выделенное волокно (диаметром 8 - 12 мкм) подМБСукладывают на гистологическую лопатку и осторожно переносят в емкость,После смывания волокна с лопатки в емкость лишнюю жидкость отсасывают. Емкость закрывают вторым покровным стеклом. Ооразовавшуюся таким образом микрокамеру переносят под микроскоп типаМБИ.10Сначала препарат изучают и фотографируют под обычным микроскопом МБИснасадкой МФНв проточном раствореРингера, зарисовывают, измеряют, а затемисследуют физиологические параметрымембраны по методике фиксации потенциала. Для этого волокно переносят в электрофизиологическую камеру, поверх смежныхинтернодальных сегментов накладываютвазелиновые перегородки. Концы волоконне перерезают, а размещают вместе с кусочками ствола в соседних отсеках камеры, содержащих изотонический раствор114 мм/л КС 1,Вначале определяют способность перехватов генерировать потенциал действия, азатем с помощью методики фиксации напряжения регистрируют ионные токи перехвата. Натриевые токи (Ъа) определяют повеличине пика входящего тока, а калиевые(/к) - по стационарному уровню тока придлительности импульсов 5 мс. Линейнуюкомпоненту ионного тока (ток утечки /)измеряют с помощью гиперполяризующихимпульсов той же длительности. Из вольтамперных характеристик находят значениенатриевой (б,га) и калиевой (бк) проводимостей при мембранном потенциале в=0.Вычисляют также проводимость утечки 6,.В качестве физиологических параметров, не 40зависящих От калибровки измеряемой величины Ув, выбраны отношения проводимостей ба/6, и бк/бь учитывая их важнуюроль в генерации потенциала действия.П р и м е р 1. При микроскопическом 45анализе под объективом 10 Х у препаратанервного мякотного волокна диаметромОкОлО 12 мкм фОрма луковицы перехватабыла оценена нормальной. При последующем анализе под средним (40 Х) увелпчением конус перехвата квалифицирован какнезначительно измененный за счет начального расслоения миелина. Расстояние между мякотными конусами 1,5 мкм. Волокно признано нормальным. При электрофизиологической проверке функциональные характеристики ионных каналов, непосредственно измеренные в дальнейшем ходе опыта, составляли величины: бра/6, =- 13; бк/61=7; бра/бк = 1,9; 61 -- 0,022. Потенциал действия генерируется. Вольт-амперные характеристики свидетельствуют о хорошем функциональном состоянии мембраны, что подтверждает нормальное состояние волокна.П р и м е р 2, При микроскопическом анализе перехвата под малым (10 Х) увеличением (диаметр волокна 10 мкм) форма луковицы была оценена как нормальная. При последующем анализе под объективом 20 Х заметно полное исчезновение одного из конусов, Второй конус резко деформирован расслоением миелина и едва заметен. Измерение с помощью микрометра расстояния между смежными сегментами ретрагированного мнелина равно 3,8 мкм. Волокно определено обратимо измененным.Проверочные измерения в установке для фиксации потенциала выявили следующие удовлетворительные характеристики: бм/61 = 3; бк/61 = 5,5; бра/бк = 1,5;6, = 0,2. Потенциал действия, однако, не возникал. Это подтверждает функциональное обратимое состояние волокна.П р и м е р 3. При микроскопическом анализе уже под объективом 10 Х обнаруживается деформация обеих луковиц перехвата. В результате расслоения миелина и его ретракции левая луковица вместо сферической формы имеет контур в виде зазубренной полусферы. Правая луковица деформирована слабее, Расстояние между миелином измененных смежных сегментов 6,5 мкм. Волокно определено как необратимо измененное.В данном конкретном опыте электрофизиологическая проверка выявила следующие величины: бра/61 = 2,3; бк/61 = 2,7; бра/бк = 0,8; 61 = 0,4. Это функциональное состояние такого волокна следует оценить как необратимо измененное.Предлагаемый способ позволяет с помощью морфологических исследований и измерений количественно определить некоторые физиологические характеристики аксона. Это реализуется путем микроскопического810222 Составитель С. МалютинаРедактор Т. Зубкова Техред А. Камышникова Корректор А. Степано Заказ 506/4 Изд210 Тираж 694 ПодписноНПО Поиск Государственного комитета СССР по делам изобретении и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 415 Типография, пр. Сапунова,анализа и измерения степени повреждения элементов глиальной шванновской клетки, тесно связанных функционально и морфологически с аксолеммой в зоне перехвата. Этот способ существенно облегчает работу 5 с препаратом, дает возможность планировать вид эксперимента, экономит время исследователя,Изобретение позволяет расширить исследования нервного волокна при травме нер ва и влиянии специфических токсинов. Выявленные соответствия физиологического состояния морфологическим характеристикам позволяют охарактеризовать изменения как допускающие или ограничивающие дальнейшие действия при лечении или инструментальном электрофизиологическом исследовании,Формула изобретения 20 Способ витальной микроскопии нервного волокна, предусматривающий его расщеп ление, выделение одиночного перехвата Ранвье, отличающийся тем, что, с целью определения функционального состояния нервного волокна, на препарате последовательно определяют форму луковицы и конуса и измеряют величину щели между ними, и при форме луковицы ог шаровидной до полусферы и размерах щели от 4 до 7 мкм определяют необратимо измененное волокно, при шаровидной форме луковицы с расщепленным конусом и размерах щели от 2 до 4 мкм определяют обратимо изменение волокна, а при шаровидной форме луковицы с нормальным конусом и размерах щели от 0,3 до 2 мкм определяют нормальное волокно.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе 1. Сотников О. С. Функциональная морфология живого мякотного нервного волокна. Л., Наука, 1976, с, 17 - 31.