Способ получения полисахарида, обладающего противоопухолевым действием

ИностранцыТикао Есикуми, Тосихико Вада, Масахико Фудзии,Хиромицу Макита, Кинзабуро Сузуки, Акио Санмиои Харухиса Хаяси(Япония)Иностранная ФирмаКуреха Кагаку Когио Кабусики Кайся(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИСАХАРИДА, ОБЛАДАЮЩЕГО ПРОТИВООПУХОЛЕВЫМ ДЕЙСТВИЕМ Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для приготовления медикаментов.Известен способ получения поли- б сахарида, обладакщего противоопухолевым действием путем глубинного культивирования продуцента,отделения мицелиальной массы с последующей экстракцией иэ нее целевого продукта горячей О водой и очисткой экстракта от балластных примесей (протеинов низкомолекулярных веществ) известными приемами 1.Однако этот способ не обеспечива ет получения полисахарида с высокой противоопухолевой активностью. Целью изобретения является повышение противоопухолевой активности 20 полисахарида.Цель достигается тем,что в качест- ве продуцента используют штамм Сог 1 о 1 ив чегя 1 со 1 ог (Рг) 0 це 1. РЕЯМ-Р, Сог 1 о 1 ы сопяогя (ВегМ.) Ував. ф) РЕЯМ Р, Сог 3 о 1 ця Ь 1 гяц 1 ия (Рг.) це 1. РЕЯМ-Рили Сог 1 о 1 ия разврат щепцв (Рг.) РаС. РЕЯМ-Ркласса ВавЫЗопусе 1 ея и перед экстракцией полученную культуральную жидкость безЖ отделения мицелия высушивают при температуре б 0-150 фС. Способ полччения полисахарида заключается в томчто грибок относящийся к кориолюсу класса базидиомицетов подвергают погруженному культивированию в жидкой среде, полученную питательную среду сушат при температуре 60-150 С и подвергают экстракциононой обработке водным растворителем с последующей очисткой полученного экстракта путем удаления из него веществ с мсжекулярным весом менее 5000Культивирование грибков класса базидиомицетов проводят в жидкой среде в условиях аэрации и пеоемешивания, причем рост мицелияпроисходит не на поверхности жидкой среды, а в основном в глубине жидкого слоя. Выращивание проводят при скорости аэрации от 0,1 до 2,0 л/мин/л среды и при скорости вращения мешалки от 30 до 800 об/мин.В качестве среды используют любую натуральную или синтетическую среду, которую обычно применяют при выращивании микроорганизмов. Вьтоащивание длится 3-10 дней.40 Молекулярный вес находится в пределах от 5000 до Э 00000.. Азотосодержащий полисахарид обла- бОдает очень сильным противоопухолевым действием,. проявляемым пои лечении мышейне только пои внутрибрюшинном введейии в организм, нотакже и при введении через оот. 65 В случае погруженного культиви-рования с использованием жидкой соеды мицелиф не оаспростоаняется на поверхности среды с образованием больших масс, а Формируется в виде небольших шарикоподобных или волокйистых масс, создаваемых пеоемешиванием. В ходе такого процесса полисахарид образуется не только внутоимицелия, ио также в самой соеде.Ратем питательную среду подвеогают сушке, которую проводят при температуре от 60 до 150 С, Для сушкииспЬльзуют барабанные газоструйныесушилки и тонкопленочные выпаоныеаппараты.15В результату такой обработки упоощается экстракпия водньм,оасгвооителем, а также сбор полисахарида посредством очистки экстракаионного раствора,После обработки сУшкОЯ осушест - вляют экстракпию водным раствором,содержащим щелочь, соль (напоимерхлористый натрий, ацетат натоия),полярным органическим растворителем(например метанол, этанол) . Наиболее 25эффективной является экстракпия снагреванием водой или разбавленнымраствором щелочи.Полученный экстрактный раствоозатем подвергают обработке с целью ЗОочистки этого раствооа путем удаления из него веществ с молекулярнымвесом менее 5000, что позволяет получить целевой полисахаоид. Такуюобоаботку пооводят высаливанием,диализом, ультрайильтрацией, гелевымФильтрованием или осаждением органическим растворителем.После удаления низкомолекулярныхкомпонентов (с молекулярным весомменее 5000) из экстоактного раствора его подвергают распылительнойсушке или сушке вымораживанием споследукщим приготовлением технической продукции.Полисахариды, полученные поедлагаемым способом представляют собойвещества печеночно-кооичневогоцвета с содержанием азота от 2 до8%; полисахариды не имеют точкиплавления, а постепенно темнеют и 50разлагаются при температуое, превышающей приблизительно 12 ООС. Вещество растворимо в воде, но почти неоастворимо в спирте, пиридине, хлооофооме,бензоле и гексане,.оно почти безвкусно и не обладает запахом. Предлагаемое вещество может бытьиспользовано не только для предотвращения нежелательных побочныхэффектов в химиотерапии рака и повышения чувствительности к радиотерапии, но также для предотвоащения отклонений восприимчивости илифизического здоровья пациента, воз-никаюших после хирургических опеоаций или переливания крови, а такжедля борьбы с вирусными и бактериальными заболеваниями.П р и м е р. 1600 л питательнойсреды, содержащей 10 глюкозы,1,5% дрожжевого экстракта, 0,1 Ъ первичного кислого фосфата калия и0,1 гептагидрата сульфата магния,загружают в Ферментор, после чегопитатеяьную среду инокулируют 20 лшлама грибков штамма Сог 3 о 1 цз чегз 3 соХог (Рг) 0 це 1. ГЕЖ-Р.414, полученного встряхиванием культуры споследующим культивированием в течение 7 дней при температуре 26 С,скорости аэрации 0,5 л/мин/л среды и скорости вращения мешалки 150 об/мин,Приготовленный таким обоазомбульон (шлам) делят на 500-литоовыепорции, после чего каждую из этихпорций сушат в сушилке типа с двойным барабаном, Температуоу поверхности барабанной сушилки регулиоуюттаким образом, что температура поверхности питательного бульона (поверхность бульона опоеделяют формированием тонкого слоя бульона на поверхности барабана) равна соответственно 65 , 80 , 90 , 110 и 145 Си содержание воды в каждой порциивысушенного продукта составляет менее 20 вес.Ъ.Затем вкаждую из этих порцийвысушенного продукта добавляют по250 л горячей воды и проводят экстракционную обработку пои темпеоатуре 95+1 ОС в течение 3 ч, а послеохлаждения мицелиальный остатокотделяют от экстрактного оаствора сиспользованием декантатора шнековоготипа и с разделением в центробежном сепараторе пластинчатого типа .Полученные полисахаоидные продукты представляют собой коричневыйпорошок, легко растворимый, в воде.Полисахарид, полученный с применением сушки при температуре 60-150 Собладает высокойингибируюшей актив ностью.Полисахарид подавляет рост опухолей.Были проведены следующие опыты,Клетки опухоли саркомытоансплантируют внутрибрюшинно в организммыши и после 7-дневного удовлетворительного роста этих клеток вновьтрансплантируют под кожу аксиллярнойобласти другой мыши с получениемтвердых опухолей. Предлагаемое вещество вводят внутрибрюшинно в коЗаказ 2970/53 Тираж 522 Подписное ЦНИИПИ Государствениого комитета ГГГР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5филиал ППП Патент, г. ужгород, ул, Проектная, 4 личестве 10 мг/кг один раз в деньв течение 20 дней при общей дозе0,2 мл/20 г (вес мыши), а при пероральном введении это вещество дают вколичестве 1000 мг/кг,в день в течение 20 дней с введением общего количества 0,2 мл/20 г (вес мыши)Ядра клеток всех опухолей погибают по истечении 25 дней после трансплантации, степень подавления опухоли рассчитывают по среднему весу опухолей в группах мышей, которьй вводят предлагаемое вещество и среднему весу опухолей мьааей контрольной группы.Предлагаемый способ позволяет15 получить препарат, обладающий высокой противоопухолевой активностью. Так, величина активности препарата, полученного известным и предлагаемым способами 100 и 95-98 соответст венно, но при этом доза введения предлагаемого препарата 10 мг/кг, т. е. в 60 раз меньше дозы известного (600 мг/кг) . Препарат может быть использован вмедицине при лечении злокачественныхопухолей.Формула изобретенияСпособ получения полисахарида,обладающего противоопухолевым действием, путем глубинного культивирования продуцента с последующейэкстракцией и очисткой целевого продукта, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью повышения противоопухолевой активности, в качестве.продуцента используют штаммСогХо 1 цз чегз 1 со 1 ог (Гг) Оце 1. РЕВМ-Р, .Сог 1 о 1 цз сопзогз (Регк.)Зваз. РЕВМ-Р, Сог 3 о 1 цз Ьгзцгцз(Рг.) Оце 1. РЕВМ-Рили Гог 3 о 1 цзращащепцз (Ех,) Раг РЕВИ-Р класса Ваз 1 Жощусе 1 ез, и пеоед экстракцией полученную культуральнуюжидкость без отделения мицелия высушивают при температуре 60-150.Г.Источники инФормации,принятые во внимание при экспертизеЗаявка ЯпонИИ Е 50-3234,кл. 30 А 32, ойублик. 1975.