Способ получения моноклонального иммуноглобулина

(71) Заявитель Второй Московский ордена Ленина Государственныймедицинский институт им. Н, И. Пирогова(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА Изобретение относится к области медицины, в частности к иммунологии, и может быть использовано для приготовления препаратов иммуноглобулина высокой степени очистки.Известен способ получения моноклонального иммуноглобулина путем культивирования плаэмоцитома на питательной среде с последующим удалением продуцента иэ культуральной жидкости и очистки целевого продукта 11..10По известному способу опухоль извлекают из организма животного, освобождают от стромальных элементов, разделяют на мелкие фрагменты (порядка 1 ммЗ),15 Полученную массу промывают изотоническим солевым раствором, помещают в медленно вращающийся культиватор добавляют среду, содержащую Ь -аминокислоты, 0,5% овальбумина, набор витаминов, пенициллин, канамицин в стандартном растворе Хэнкса. На 100 мл среды вносят 50-150 мг опухолевой массы. Увеличение концентрации плаэмоцитомной массы приводит к быстрой гибели клеток,Культуру фрагментов солидной плазмацитомы инкубируют в течение 24-48 часпри 37 С, После окончания процесса культивирования клеточную массу удаляютпутем центрифугирования при 18000 втечение 20 мин, Супернатвнт, свободныйот клеточных элементов, диализуют дляосвобождения от низкомолекулярных продуктов: аминокислот, витаминов и солей.Раствор лиофильно высушивают и расворяют сухой остаток в 0,1 мл физиологического раствора, Полученный образецсодержит многоканальный иммуноглобулин, овальбумин и продукты распавшихсяклеток. Выход моноклонального иммуноглобулина определяют аналитическими методами, например методом радиоиммуноэлектрофореза, чувствительность которогосоставляет 1 мкг, причем при использовании 0,1 мл концентрата общее содержание моноклонального иммуноглобулинав исходной среде не превышает нескольких микрограммов,3 6867Основным недостатком известного способа является низкий выход монокдонедьцого иммуноглобулина.Длительное культивирование фрагментов солидной опухоли требует внесения в среду поддерживающих белков сыворотки крови, например овадьбумина, что требует при выделении цедевого продукта сложной и многократной очистки от сывороточных белков. Механическое разрушение солид ной опухоли до ее фрагментов сопровождается гибелью части клеток. В культуре из разрушенных клеток выделяются протеолитические энзимы, которые переваривают часть секретируемого иммуноглобу лина, Это сопровождается уменьшением выхода и снижением качества специфи ческого белка - иммуноглобулина. Кроме того, культивирование клеток иди фрат- ментов плазмецитомы невозможно в обыч ных микробиологических средах без добавления поддерживаощих белков и витам 1- нов. Внесение последних усложняет технику получения моноклоиадьных иммуноглобулинов, а также делает ее дороже.Белью изобретения является увеличение вьхода и повышение иммунохимической чистоты препарата.. Это достигается тем, что прн предлагаемом способе получения монокдонального иммуноглобулина путем культивирования,плазмоцитома на питательной среде с последующим удалением продуценте из культурельной жидкости и Очистки делив о го продукта пдязмоцитом вместе с фиб35 розной капсулой и предлежащими тканями культивируют в условиях аэрации в течение 6-8 час. Способ осушествдчют следрощим обра 40зом,Для получения моноклонадьного иммуногдобупина используют культуру цельнойсолидной опухоли (пдазмоцитоме) выделенной вместе с О. мужающей ее фиброз 45ной капсулой и предлежащим участкомткани. В качестве питательной среды используют обычную микробиологическуюсредунапример среду 199., Опухоль инкубирувт в среде в течение 8-8 час50при 37 ОС и и условиях аэрации карбогеном и затем уделяют.В среде остаются иммуногдобулины илиих полипептидные цепи, при этом выход55целевого продукта составляет 120-150 мгиммуцогдобулина или 30-40 мг свободныхполипептидных цепей при инкубации 6 гСОДИДПОй ПдаэмоцИтоМЫ,П р и м е р 1 Мышиные солидные пдазмоцитомы линии МОРСи МОРС- -406, секретирувшие иммуцогдобулин классов С и Л соответственно размером 2 х 2 см (около 4-6 г весом) осторожно вылущивают из ткани животного вместе с фиброзной кепсулой и прилежащим участком брюшины и промывают в физиологическом растворе. Опухоль помещают в сосуд, содержащий 100 мл среды 199. Культуру аэрируют пропусканием газовой смеси кербогена (95% кислорода и 5% углекислого газа) и через 6-8 час кудьтивирования ткань извлекают и переносят в свежий обьем исходной микробиологической среды. Процедуру культивирования опухоли повторяют 2-3 раза. Затем культуральнув среду центрифугируют при 10000 ф в течение 10 мин для удаления мелких фрагментов ткани и клеток, Прозрачный раствор среды содержит чистый иммуногдобулин. Для Освобождения целевого продукта От аминокислот образец подвергают ионообменной хроматографии на ДЕцеллюлозе в градиенте концентрании фосфатного буфера 0,01-016 М (рН 81), Иммуноглобудин эдюируют в виде Остроконечного пика в соответствующем ему значении молярной концентрации буферного раствора.Образцы иммуноглобудина .анализируют электрофорезом в 75%-ном подиакридамидном геле и иммуноэлектрофорезом, Иммуноглобулин дает гомогенный пик в полиекридамидном геле и образует одну дугу преципитации при иммуноэлектрофорезе. Таким образом, подученный образец иммуцоглобулина иммунохимически и физически чистый. Выход иммуноглобудина 150 мг из 8 г опухоли.Перед упаковкой образцов препараты иммуногдобулина диализуют в течение 12 час против 500 об. дистиллированной воды и диофидьно высушивают. Готовый продукт запеивают в ампулы и в таком виде хпанят.П р и м е р 2, Солидную опухоль, продуцируюшую ЭЯ" А (Сэ Л. типа) МОРС, выделяют с предлежащей тканью и помешают в микробиологический культиватор. Затем с помощью перистадьтического насоса создают непрерывное протекание среды 199 со скоростью 100 мд за 6 чес, Количество опухолевого материала в этом случае составляет4-6 г. Выход моноклонального иммуноглобудина в вытекающей среде за 24 час500-600 мг.5 6867Дальнейшую очистку и анализ проводят обычным способом, По иммунохимическим и физическим свойствам препарат соответствует моноклональному иммуноглобулину.5П р и м е р 3, Солидную опухоль весом 4-6 г, продуцирующую свободные :. легкие К-цепи иммуноглобулина линии МОРСвыделяют совместно с предлежащей брюшиной и фиброзной капсулой, промывают физиологическим раствором и помещают в сосуд, содержащий 100 мл среды 199, Культуру аэрируют газовой смесью карбогена в течение 6-8 час, Ткань извлекают и переносят в свежий5 питательный раствор для повторного культивирования.Культуральную среду фильтруют на бумажном фильтре "Ватман" или любом20 другом с соответствующим ему размером пор. Прозрачный фильтрат содержит чистые К-цепи. Для освобождения от ингредиентов среды раствор подвергают хроматографии на ДЕ-целлюлозе. Свободные легкие К-цепи элюируют в виде одного компонента. Количественный выход целевого продукта - около 30 мг, По иммунохимическим свойствам данный белок соответствует К-цепям.зоВозможно многократное, например 2-3 раза, использование того же материала, при этом количественный выход изменяется незначительно.В случае промышленного производства З 5 иммуноглобулина культивирование опухо 33пи целесообразно проводить в обтекающей солидную плазмоцитому среде.Предлагаемый способ получения моноклонального иммуноглобулина по сравнению с известным способом повышает выход и иммунохимическую чистоту препарата.Препарат моноклонального иммуноглобулина, получаемый по предлагаемому способу, необходим для использования в экспериментальной и клинической медицине для диагностики миеломы и иммунодефитных состояний. Препарат может найти спрос как в нашей стране, так и за рубежом.формула изобретенияСпособ получения моноклонального иммуноглобулина путем культивирования плазмоцитома на питательной среде с последующим удалением продуцента из культуральной жидкости и очистки целевого продукта, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью увеличения выхода и повышения иммунохимической чистоты препарата, плазмоцитом вместе с фиброзной капсулой и предлежащими тканями культивируют в условиях аэрации в течение 6-8 час.Источники информации, принятые во внимание при экспертизе1. СеЮоог ТлтипоГоЧ1973, М 9 2, с. 26.1-26,11.Составитель А. БражниковаРедактор А. Бер Техред 3, фанта Корректор М. ВпгулаЗаказ 5587/5 Тираж 672 Подпис ноеБ НИ И ПИ Гос удар стве нного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул, Проектная, 4