Способ определения концентрации фибронектина в растворе

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(71, Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии и Казанский медицинский институт им, С.В. Курашова (53) 612.115(088.8)(54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ФИБРОНЕКТИНА В РАСТВОРЕ путем добавления к исследуемомураствору агглютинируемых частиц, покрытых желатиной, с последующей регистрацией агглютинации,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью повышения чувствительности способа, в качестве агглютинируемых частиц добавляют клетки БарЬу 1 ососсцверЫегшЫдз, ковалентно связанныес желатиной глутаровым альдегидом инкубацией в течение 1-2 ч при рН 7,58,0 при концентрации желатины 0,10,5 Х.51 2 ВНЩШИ Заказ 5751/31 Тираж 823 Подписное филиал ППП "Патенти, г. Ужгород, ул.Проектная,4 1 11070Изобретение относится к медицинской биохимии, в частности к химии белка и, клинической лабораторной диагностике.Известен способ определения концентрации фибронектина путем добавления к исследуемому раствору агглютинируемых частиц, покрытых желатиной, с последующей регистрацией аглютинации 11.Этот способ характеризуется недостаточной чувствительностью (не более 0,3-0,5 мкг).Кроме того, к недостаткам способа относятся его длительность, необходимость использования дорогостоящего оборудования и труднодоступность ком-. понентов, необходимых для приготовления агглютинируемых частиц на основе карбоксилатекса. 20Цель изобретения - повышение чувствительности способа.Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения концентрации фибронектина в растворе пу"25 тем добавления к исследуемому раствору агглютинируемых частиц покрытых желатиной, с последующей регистрацией агглютинации, в качестве агглютинируемых частиц добавляют клетки БеарЬу 1 ососсцз ер ЫегшЫз, ковалентно связанные с желатиной глутаровым альдегидом инкубацией в течение 1-2 ч при рН 7,5- 8,0 прЦ концентрации желатины 0,1-0,5%.Способ осуществляется следующим35 образом.Получают желатинизированные стафилококки, предварительно убитые нагреванием при 80 на водяной бане в течение 30 мин. Для этого взвесь убитых клеток БТарйу 1 ососсиз ерЫегшЫз с концентрацией 20 млрд/мл в О, 15 М К 2 НР 04 смешивают с 0,1% раствора глутарового альдегида в О, 15 И К 2 НР 04 и перемешивают в течение 1 ч 45 при 370 Затем раствор подкисляют НСЕ до рН 5,0 и отделяют суспензию клеток центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 мин. Отмытый осадок суспендируют в 0,15 М К 2 НРО 4 до концент 50 рации 10 млрд/мл, смешивают с О, 1- 0,5%-ным раствором желатины и инку" бируют в течение 1-2 ч при рН 7,5- 8,0. Желатинизированные клетки отделяют от непрореагнровавшей желатины центрифугированием и трижды промывают 0,15 М К НРО, при 4000 об/мин в течение 15 мин, после чего суспендируют в растворе Хенкса (рН 7,2-7,4) до конечной концентрации 2 млрд клеток/мл. Желатинизированные клетки хранят в ампулах, запаянных и прогретых в течение, 1 ч при 80 С.Для постановки агглютинационной пробы в микротитрационных пластинах создается ряд 2-кратных разведений раствора очищенного фибронектина.в растворе Хенкса с исходной концентрацией белка 200 мкг/мл, Разведение делают раствором Хенкса, содержащим 20 ед/мл гепарина. Объем пробы, вносимый в первое углубление пластины, составляет 10.мкл. После перемешивания в каждое углубление вносят по 10 мкл желатинизированных стафилококков. В две контрольные лунки вносят 10 мкл суспензии нежелатинизированных Фстафилококков и 10 мкл фибронектина (200 мкг/мл в растворе Хенкса с гепарином 10 мкл суспензии желатинизированных стафилококков и 10 мкл раствора Хенкса с 20 ед/мл гепарина. Пластину инкубируют при 37 С в течение 1 ч. Регистрация результатов проводится визуально или микроскопически. Концентрацию фибронектина в сыворотке определяют, делая ряд аналогичных разведений исследуемой сыворотки и сравнивая результаты агглютинации с результатами агглютинации стандартных разведений Фибронектина.Предлагаемый способ по сравнению с известным обеспечивает более высокую чувствительность (0,125 мкг в пробе), 10-кратное сокращение времени определения, использование меньшего объема анализируемого раствора, прямую визуальную или микроскопическую оценку результатов определения, использование легкодоступных материалов для приготовления агглютинируемых желатинизированных частиц. Предлагаемый способ не требуетиспользования сложного оборудованияи может быть легко воспроизведен вклинических и медико-биологическихлабораториях.