Способ получения ферментного препарата n-ацетил глюкозаминидазы

ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ нительн к аьт. свид 51) М. Кл. С 12/282.76 (21) 24276 заявки Мв присоединение ударственнын комите 23) Приоритет - 43) Опубликован СССР ло делам изобретений и открытий12.81. Бюлле снь Ъэ 23.12.8 45) Дата опубликования описани Д, ПаюодисА Глемжа Томкявичюс, В адегимас, А-С И, Лауцюс следовательск й энзимологии(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕ РЕПАРАТА Л/-АЦЕТ ИЛ-ГЛ Ю КОЗАМ НОГОИДАЗЬ ЯНаиболее бли ности является с Х-ацетил-глюкоз вирования бакте бинным способок 40 л, наполненно В качестве истоИзобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для получения разной степениочистки ферментов У-ацетил-глюкозаминидазы на основе выращивания бактерий 5Вас 111 цв эпЫ 111 э Ст - 19,Известны способы получения ферментного препарата Ж-ацетил-глюкоз ам инидазыпутем глубинного культивирования микроорганизмов, например Ягертотпусез дг 1- 10вецэ, АТСС Хв 27800, который выращиваюттрое суток на качалках в колбах емкостью2 л, содержащих 1 л питательной среды,состоящей из раствора 1%-ной коллойднойсуспензии хитина и минеральных солей. 15Эндо+Ж-ацетил-глюкозаминидазы выделяют из культуральной жидкости путемотделения биомассы через бумажныйфильтр с последующим многостадийнымосаждением ее из фильтра солями цинка и 20сернокислого аммония и очисткой на хроматографических колоннах с целлюлозой эким по технической сущпособ получения препарата аминидазы путем культирии Вас 11 цз эиЫ 111 э глу в ферментере емкостью м 20 л питательной среды, ника углерода используют 1 г/л глюкозы, 5 г/л азота-бактопелтон и (К 2 НР 04), минеральной соли: КНР 04 - 0,4 г/л, Мд 504НаО - 0,05 г/л, ХаС 1 - 0,1 г/л РеС 1 . 6 Н 20 - 0,017 г/л, (МН 4)НР 04 - 0,5 г/л, Ферментацию прог,одят при 37 С с постоянной подачей стерильного воздуха со скорость 20 л/мин. Продолжительность ферментации 20 ч, Бактерии выделяют Л-ацетил-глюкозаминидазу в культуральную жидкость, в основном в виде нерастворимой формы, адсорбированпой на клетках бактерий. После ферментации фермент и клетки бактерий собирают центрифугированием. У-ацетил-глюкозагиинидазу экстрагируют из осадка 0,1 М трисбуфером (рН - 8,0), содержащим 3 - 4 М КаС 1. Потери на данной стадии составляют 62,5%. Далее фермент очищают при помощи ультрафильтрации, гель-фильтрации и ионной хроматографии 121.Однако существующий способ получения Л/-ацетил-глюкозампнидазы является неперспективным потому, что для биосинтеза фермента требуются дорогостоящие и дефицитные органические источники питательной среды. Фермент выделяется в культуральную жидкость в виде нерастворимой формы. Для его экстракции необходимы дополнительные технологические операции, причем потери на данной стадии слишком3велики. Г 1 роцесс ферментации сравнительно продолжителен.Цель изобретения - получение препарата У-ацетил-глюкозаминидазы с повышенным выходом и его удешевлением.Цель достигается тем, что в качестве продуцента бактерий из вида Вас 111 цз зцЬ 1111 з используют штамм Вас 111 цз зцИ 11 з 6-19, при этом культивирование осуществляют в течение 13 - 15 ч, а в качестве источника углерода и азота используют осахаренный крахмал, кукурузный экстракт и пивные дрожжи.Штамм характеризуется следующими морфологическими и культурально-физиологическими признаками.Морфологические признаки. Клетки имеют форму палочек размерами 1,7 - 3,3 мк на 0,5 - 0,6 мк. Палочки располагаются цепочками. Палочки подвижные с помощью перетриховых жгутиков, грамположительны, Культура образует споры размером 1,0 - 1,5 мк на 0,7 - 0,9 мк, форма спор эллипсоидальная, реже цилиндрическая. Прорастают споры экваториально, путем разрыва мембраны вдоль экватора.Культуральные признаки. На мясо-пептонном агаре после 24-часовой инкубации в термостате культура образует колонии диаметром 2 - 6 мм, Колонии сероватые, желтоватые, непрозрачные, иногда края гладкие, складчатые в центральной части поверхности.Иногда культура твердо врастаст в агар. На ломтиках картофеля после 48 ч роста образует пленку бело-желтого цвета.Пленка сморщена и окружена выступами, быстро образует субконечные споры, иногда центральные не деформирующиеся. Пленка сухая в начале роста, становится далее вязкой. На поверхности мясо-псптонного бульона культура образует сморщивающуюся пленку бело-желтоватого цвста, мясо-псптонный бульон остается при этом г розр ачным.Физиологические признаки. Оптимальная температура роста 35 - 37 С при рН 6,2 - 6,6. Дыхание строго аэробное. Усваивает глюкозу, сахарозу и фруктозу с образованием кислоты без выделения газа. Нс усваивает лактозу, мальтозу, ксилозу, арабинозу, рамнозу, сорбит, маннит, дульцит и инозит. Гидролизует крахмал, разжижает желатину, пептонизирует молоко с образованием сгустка. Растет в среде с цитратами, Нптраты восстанавливает до нитритов. На среде Кларка образует ацетилметилкарбинол,Для выращивания бактерий Вас 1111 цв вцЫ 111 з 0-19 готовят питательную среду следующего состава, %. осахаренный крахмал 6,5; кукурузный экстракт 2,7; сухие пивные дрожжи 0,12; двухзамещенный фосфат аммония 0,5; калий сернокислый 0,33;65 Способ получения ферментного препарата У-ацетил.глюкозаминидазы путем культивирования продуцирующих его бактерий 4магний сернокислый 0,016; марганец сернокислый 0,1; кальций хлористый 0,013. Компоненты питательной среды для стерилизации делятся на три группы и стерилизуются раздельно. Питательную среду засеивают посевным материалом Вас 111 цз зцЫ 11166-19, при 45 С и рН - 6,6. В начале ферментации рН снижается до 6,2, после чегоавтоматически поддерживается рН при поХ даче 20 "/о-ной аммиачной воды в пределах6,4 - 6,6. Продолжительность ферментации13 - 15 ч. Активность У-ацетил-глюкозаминидазы определяется по вискозиметрическому методу.Пб Испытание изобретения проведено в лабораторных и полупроизводственных условиях.Культивирование проводят глубиннымспособом в ферментере емкостью 1500 л,20 при коэффициенте заполнения 50/о, т. е. в750 л питательной среды. В ферментер передают 100 л осахаренного крахмала с40 - 45 Б, 225 л раствора солей содержащего Кг 504 2,48 кг; Мд 504 0,127 кг;Мп 804 0,75 кг; ХаС 1 0,248 кг; СаС 1 0,1,кг.Раствор стерилизуют 30 мин при 130 С,Для приготовления раствора азотистыхвеществ в чан заливают 220 л воды и добавляют 20 кг 5 О/о-ного кукурузного экстзп ракта, 0,9 кг сухих пивных дрожжей, 3 лподсолнечного масла. Раствор передают всателит и стерилизуют 45 мин при 130 С,В другом сателите стсрилизуют раствордвухзамещенного фосфата (55 л воды из 5 3,75 кг (КН 4)НР 04) при 130 С в течение30 мип,После стерилизации компонгенты охлаждают до 45 СС и передают в ферментер, доводят рН среды аммиачной водой до 6,6.4 О Г 1 осле того засеивают посевным материалом Вас 111 цз зцЫ 11 Ь 6-19, затем включаютмешалку и подают стериальный воздух соскоростью 0,4 мз/мин.Спустя 4 - 6 ч температура среды пони 45 жается до 37 С и далее поддерживаетсяпостоянной во время ферментации рН среды в начале ферментации понижается до6,2, после чего автоматически поддерживастся в пределах 6,4 - 6,6.Биосинтез У-ацетил-глюкозаминидазыначинается с 8 ч ферментации, а особенноинтенсивно идет в конце ферментации.Активность У-ацетил-глюкозаминидазы вконце ферментации достигает 24 ед/мл,55 При производстве ферменгного препарата У-ацетил-глюкозаминидазы в объеме55 т в год в системе Главмикробиопромагодовой экономический эффект составляет109,5 тыс. руб.60Формула изобретения622282 Редактор Т, Кузнецова Корректор Е. Хмелева Техред Л. Куклина Заказ 8758 Изд 3 Ф 505 Тираж о 30 г 1 ПО Поиск Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Лосква, Ж, Раунская наб., д. 4/5Подписое Загорская типография Упрполиграфиздата Мособлпсполкома 5вида Вас 1 цв вцЫ 11 э на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли с последующим выделением фермента из культуральной жидкости, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода фермента и его удешевления. в качестве продуцента из вида Вас 111 цэ вцЫ 111 э используют штамм Вас 111 цэ зцэ- Иэ 6-19, при этом культивирование осуществляют в течение 13 - 15 час, а в качестие источника углерода и азота используютосахаренный крахмал, кукурузный экстракти пивные дрожжи,5 Источники информации, принятыс во внимание при экспертизе 1, Тагеп 11 по Л. 1 и Масу Яоцгпа В 1 о 1 од стегпса, 1974, 249, 3 р. 811 - 817. 2, Ог 11 г 1. М, и до, В 1 осйеп 1 В 1 ойус10 Аэ 1 а, 1972, 289 р. 174 - 186,