Способ получения белка

ОП ИКАНИЕ ИЗОБРЕТЕН ИЯ Союз Советских Социалистических Республик(23) Приоритет (32) 03.05.7 Государстеенныи комитет Совета Министроа СССР па делам изооретений и открытий(45) Дата опублико ния описания 8,01. Ю н ос транцы 2) Авторы изобретени Ярослав ек и Кнут Руд Траелнесейцария) Иностранная фирма"Сосьете де Продюи Нестле С. А.ф (Швейцария) аявитель ОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКА(5 ор дл Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано для получения внутриклеточных веществ микробиологического происхождения: белков, ферментов, нуклеиновых кислот или пигментов.Известен способ получения белка, предусматривающий культивирование микроорганизмов на питательной среде в присутствии антибиотика с последующим выделением белка 11Однако по известному способу в питательную среду, содержащую микроорганизмы, добавляют антибиотик с повышенной концентрацией, что вызывает нарушение кинетики роста микроорганизмов.Целью изобрегения является повышение выхода целевого продукта.Для достижения поставленной цели перед введением антибиотика в культуральную среду определяют его концентрацию в культуральной среде, при которой приостанавливается рост микроорганизмов, а затем в питательную среду вносят антибиотик в количестве 5% от этой концентрации.Способ заключается в следующем.Питательная среда для выращивания микроганизмов содержит вещества, необходимые я размножения клеток этих микроорганизмов, т. е. источники углерода и азота, например, углеводы и(или углеводороды, азотсодержащие вещества, минеральные соли, Она может содержать стимуляторы роста, например витамины, а также кислород, если микроорганизм живет и размножается в аэробных условиях.Микроорганизмы выращивают в ферментере, заполненном питательной средой, в условиях аэрации кислородом при температуре 20 - 50 С и рН 3,0 - 8,0. В питательную среду, желательно в показательной фазе роста микроорганизмов, добавляют антибиотик или смесь нескольких антибиотиков в таком количестве, чтобы рост не приостанавливался и чтобы протеины, содержащиеся в клетках, не выходили в питательную среду.Согласно способу определяют ряд концентраций, соответствующих системе микроорганизм - антибиотик. Верхний предел этого ряда может быть определен для рассматриваемой системы путем измерения концентрации анти- О биотика питательной среды, начиная от которой рост микроорганизма останавливается. Остановка роста происходит обычно некоторое время после добавления антибиотика в питательную среду. Для бактерии Ьагс 1 па 1 ц 1 еа 25концентрации антибиотика в питательной среде, при которых происходит остановка роста, составляют 0,05 международной единицы (МЕ) для пенициллина б, 100 мг/мл для Д-циклосерина и 30 мг/мл - для бактитрацина. Нижний предел этого ряда концентраций составляет как правило -5 О/о значения верхнего предела ряда. Это означает, что при более низких концентрациях ослабление клеточных перегородок становится незначительным и не оказывает существенного влияния на эффективность деления клеток в ходе последующего процесса разрыва.Концентрацию антибиотиков в питательной среде для рассматриваемой системы выбирают между двумя крайними значениями в зависимости от требований, предъявляемых к способу. Концентрация антибиотиков, выбранная в верхнем пределе, вызывает некоторое уменьшение степени роста микроорганизма, сопровождающееся большим увеличением числа раздробленных клеток для данного уровня энергии дробления (например для какого-то рабочего давления гомогенизатора). Если изменение кинетики роста нежелательно, целесообразнее применять более слабые концентрации антибиотиков, что предполагает использование более мощной энергии дробления (по сравнению с предыдущим случаем) для получения той же эффективности дробления.Культуру микроорганизмов выдерживают в ферментере в течение нескольких часов, затем биомассу отделяют от питательной среды, например центрифугированием, декантированием или фильтрацией, клетки промывают и переводят в водную суспензию. Суспензию подвергают механической обработке гомогенизатором или соответствующей мельницей, вызывающих разрыв клеточных перегородок.Пример 1. Бактерии Яагс 1 па 1 ц 1 еа выращивают в 1,5 л стерилизованной водной питательной среды, рН 6,5 которой устанавливают до стерилизации. Состав этой среды следующий,/о;МН,С 1 0,100Мр.10 7 Н,О 0,050К,НРО, 0,100ге 504 7 Н,О 0,001СаСВ, 1,010Пептон 1,000Дрожжевой экстракт 0,500Сахароза 0,500Вода До 100Выращивание продолжают 24 ч при 25 С в аэробных условиях в колбе, взбалтываемой путем вращения, Затем полученную культуру вВодят в 9 л водной питательной среды, находящейся в 14-литровом ферментере, Эта питательная среда имеет тот же состав, что и вышеописанная, но содержит 1 О/о дрожжевого экстракта и 2% сахарозы. Бактерии выращивают в ферментере при25 С, перемешивая питательную среду мешалкой, вращающейся со скоростью 250 об/мин; вентиляция обеспечивается путем подачи 7 л воздуха в минуту при атмосферном давлении,В показательной фазе роста в питательную среду добавляют пенициллин О с таким рас четом, чтобы получить концентрацию пенициллина, равную 0,04 Международной единицы (МЕ) намл питательного бульона. Культуру бактерий выдерживаю 9 ч, а затем отделяют бактерийные клетки от питательной среды пу тем центрифугирования,Полученные клетки промывают и помешаютво взвешенном состоянии в воду из расчета 30 г сухого вещества на 1 л воды. Затем водную суспензию обрабатывают механическим путем в дробильной установке К 1 В 1 при давлении 700 - 1000 атм. Количество разорванных клеток, определенное путем дозирования освобождающегося азота, составляет 20/О от общего числа клеток.1 Аналогичная механическая обработка, проведенная с клетками Яагс 1 па 1 ц 1 еа, выращенными при тех же условиях, но при отсутствии антибиотиков, вызывает разрыв только 4% клеток.20В то же время добавление 0,04 МЕ пенициллина б на 1 мл питательной среды увеличивает лишь на 10/О время димеризации микро. организма, т, е. оказывает очень незначительное влияние на кинетику воспроизводства мик роорганизма.Пример 2. Бактерии Вас 111 цз гпеда 1 епцгпвыращивают в 0,5 л питательной водной среды,рН которой устанавливают 6,5 до стерилизации.Состав среды, о/Озо (МН ) НРО, 1,000К,НР 04 0,500Ха 501 0,500МРО, 7 Н,О 0,400Ге 50, 7 Н,О 0,002МаСВ 0,002Дрожжевой экстракт 0,025Жидкость мацерациикукурузы 0,025Сахароза 2,000Вода До 100,Выращивание продолжают 24 ч при 30 Св аэробных условиях и при помешивании путем встряхивания. Затем 5/о полученной культуры вводят в 9 л водной питательной среды,находящейся в 14-литровом ферментере и имеющей тот же химический состав, что и инкубационная среда, Бактерии выращивают при30 С, перемешивании со скоростью 250 об/мин,расходе воздуха 7 л в 1 мин, при атмосферном давлении, В показательной фазе роста впитательную среду добавляют 4 мг/мл бактитрацина, После 9 ч роста в этих условиях5 о бактерийные клетки отделяют от питательнойсреды путем центрифугирования.Собранные, промытые и помещенные в водную суспензию клетки подвергают механической об работке аналогично примеру 1.Количество разорванных клеток, определенных по способу, описанному в примере 1, составляют 61 О/, от общего числа клеток. Аналогичная механическая обработка клеток Вас 11- 1 цз гпеда 1 епшп, выращенных в тех же условиях, но без добавки антибиотиков, вызывает6 о разрыв 26 О/о клеток.0,025 Пример 3. Бактерии .М 1 сгососсцз сегйсапзвыращивают в водной питательной среде следующего состава,%:(ЯН 4) 2 НР 04 1,000КНРО, 0,50011 а 7804 0,500МдЮ 4 7 НО 0,400Ге 804 7 НО 0,002ХаС 1 0,002Дрожжевой экстракт 0,025Жидкость мацерации зокукурузыСмесь линейныхпарафинов С- С ф 2,000Вода До 100.Культуру выдерживают в ферментере при30 С в аэробных условиях. В показательнойфазе роста микроорганизма добавляют циклосерин из расчета 100 мг на 1 мл питательнойсреды.После 8 ч роста в этих условиях клетки изолируют и обрабатывают механическим путеманалогично примеру 1. Количество разорванных клеток для культуры, выращенной в присутствии антибиотика, и для культуры, выращенной без антибиотика, составляет соответственно 75% и 57%.Пример 4. Непрерывное выращивание бактерий Вас 11 цз веда 1 ег 1 цгп производят в ферментере на бульоне, полученном в результатекультивирования бактерий в среде, описаннойв примере 2, и при тех же условиях.без добавления антибиотика.Ы аналогичных условиях выращивают те жеоактерии, но добавляют в питательную средупенициллин б из расчета 1,5 МЕ на 1 мл среды,Биомассу, отделенную путем центрифугирования от вытекающего из ферментера элюента,промывают, вводят в водную суспензию и обрабатывают в гомогенизаторе Мап 1 оп бац 11 ппод давлением 700 атм. Количество разорванных клеток для культуры, выращенной с добавлением антибиотика, составляет 65%, длякультуры, выращенной в тех же условиях, нов отсутствии антибиотика - 20%.Пример 5. Непрерывное выращивание бактерий Яагс 1 па 1 ц 1 еа производят в ферментерена питательной среде, описанной в примере 1,которая содержит 0,04 МЕ пенициллина на 1 мл.Клетки, отделенные от вытекающего из ферментера элюента, промывают, вводят в воднуюсуспензию и обрабатывают, как описано в примере 4. Количеетво разорванных клеток 25%,для клеток же выращенных в аналогичных условиях, но без антибиотика - 5%.Пример б. Бактерии 1.ас 1 оЬас 111 цз Ьече 11 сцз АТСС45807 выращивают в аэробныхусловиях на питательной среде, представляющей собой раствор в деминерализованной водетвердых веществ сыворотки молока и 0,1 вес.%жидкости мацерации кукурузы, Среду стерилизуют 30 мин при 120 С. Выращивание произ 55водят в 14-литровом ферментере при температуре 42 С и перемешивании мешалкой со скоростью вращения 15 об/мин. рН среды поддерживают равным 5,5, добавляя водный раствор гидроокиси калия. Спустя 5 ч после посева бактерий в питательную среду добавляют стерильный раствор пенициллина 6 с таким расчетом, чтобы концентрация его составляла 0,03 МЕ на 1 мл среды. В этих условиях выращивание продолжают 15 ч, затем отбирают 9 л полученного питательного бульона, клетки отделяют центрифугированием, промывают и помещают в водную суспензию.Водную суспензию подвергают механической обработке в гомогенизаторе Мап 1 оп бац 1 п под давлением 700 атм. Разрыв клеток для культуры, выращенной в присутствии антибиотика, составляет 90%, для культуры, выращенной без антибиотика - 55%.Пример 7. Бактерии 5 агс 1 па 1 и 1 еа непрерывно выращивают в питательной водной среде состава, %:ХН С 0,100Мд 50, 7 Н,О 0,050К.НРО 0,100Ге 50, 7 Н.О 0,001СаСь 0,001Пептон 1,000Дрожжевой экстракт 0,500Сахароза 1,500Вода До 100.Питательная среда, непрерывно вводимаяв ферментер, содержит 0,04 МЕ пенициллина Сз на 1 мл. Выращивание производят при 27 С в аэробных условиях при перемешивании со скоростью 400 об/мин.Клетки, отделенные от вытекающего из реактора элюента, промывают и вводят в водную суспензию, а затем обрабатывают механическим путем в гомогенизаторе Рцпо - М 111 (производительность 5 л/час, снабжен стеклянными шариками диаметром 0,2 мм).Происходит разрыв 85% клеток; при аналогичной механической обработке водной суспензии клеток, выращенных при тех же условиях, но без антибиотика, происходит разрыв лишь 65% клеток.формула изобретенияСпособ. получения белка, предусматривающий культивирование микроорганизмов на питательной среде в присутствии антибиотика с последующим выделением белка, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, перед введением антибиотика в культуральную среду определяют его концентрацию в культуральной среде, при которой приостанавливается рост микроорганизмов, а затем в питательную среду вносят антибиотик в количестве 5% от этой концентрации.Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:1, Патент Великобритании1 141 940,кл, С 6 Г, 1969.