Способ выделения ферментов

(11) 516740 Союз Советских Социалистических Республик(45) Дата опубликования описания 3009.77Гоеударетаенный комитетСонета йенннетров СССРно делам наобретеннйн открытнй(54) СПОСОБ ВЦЦЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТОВ ИЗ ЖИДКИХ РАСТВОРОВИзобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для выделения пектолитических, амилолитических, протеолитических и целлюлолитических ферментов, 5 широко применяемых в биологии, медицине, а также в пищевой, комбикормовой и легкой промышленности, сельском хозяйстве и других областях науки и техники.Известен способ выделения ферментов из жидких растворов, включающий вспенивание раствора путем пропуска через него воздуха.Недостатком известного способа яв ляется: сложность процесса выделения ферментов, заключающаяся в длительной технологической схеме образования, отделения и очистки осадка, состоящего из фермента и сульфата аммония; а 20 также низкий выход ферментов за счет потерь ферментов, переходящих в пену, которая образуется при растворении сульфата аммония и в дальнейшем не используется; и за счет неполного осаждения ферментов.С целью устранения указанного недостатка и увеличения выхода ферментов по предлагаемому способу перед вспениванием в раствор вводят сульфат 30 аммония, полученную смесь перемешивают, а пену собирают и концентрируют,Целесообразно воздух на вспениваниеподавать в количестве 0,05-0,2 объемана объем смеси в 1 мин.Предлагаемый способ выделения ферментов осуществляют следующим образом.Микроорганизмы - продуценты Ферментовкультивируют глубинным или поверхностным способом с последующим отделениембиомассы микроорганизма от жидкой Фазы.Нативный раствор или экстракт концентрируют любым известным способом ипри перемешивании растворяют сульфатаммония до насыщения, необходимогодля получения фермента из жидкости прирН смеси, близком к изозлектрнческойточке выделяемого фермента. Полученнуюсмесь одновременно перемешивают и барботируют воздухом в количестве 0,050,2 объема на объем смеси в 1 мин,Образующуюся обильную пену собирают в отдельную емкость и концентрируют. Перемешивание и барботаж заканчивают спрекращением пенообразования, т,е. когда максимальное количество ферментаиз жидкости перешло в пену, сульфатаммония практически весь остается врастворе. Пену собирают и концентрируют, 516740Жидкость, образующаяся при концентрации пены, представляет собой очищенный ферментный препарат, содержащий следы сульфата аммония (0,1-0,2).Количество образовавшейся жидкостисоставляет 0,1-0,5от первоначального объема нативного раствора или экстракта,П р и м е р 1. Культивированиемикроорганизмов - продуцентов пектолитических ферментов осуществляют приоптимальных условиях в ферментере ем 3костью 65 м на питательной среде соответствующего состава. Для отделениябиомассы глубинную культуру фильтруют,а ферментный раствор концентрируют.Ферменты выделяют из концентрата путем добавления сульфата аммония до коэффициента насыщения 0,8 с таким расчетом, чтобы рН смеси был равен 4,5(подкисление пРовоДЯт 0,1 н НзРОдо20рН 2,5-3,0) . Смесь активно перемешивают. После полного растворения сульфата аммония смесь барботируют воздухом в количестве 0,1 объема на объемсмеси в 1 мин.Образующуюся пену собира ют и гасят силиконовым пеногасителем вколичестве 0,001 к объему собираемойвоздушной суспензии /пены/. Перемешивание и барботаж заканчивают с прекращением пенообразования.После добавления пеногасителя, пена гасится иобразующаяся жидкость представляет собой высокоактивный очищенный концентрат пектолитических ферментов, из которого препарат выделяют методом лиофильной сушки.С 1 м культуральной жидкости посВле вакуум - концентрирования получают 100 л концентрата, а после осаждения сульфатом аммония, сбора и гашения пены,2 л ферментного раствора,высушенного на лиофильной сушилке.Выход препарата по активности квакуум-концентрату 97,8.П р и м е р 2. Получение ферментного раствора пектолитических ферментов осуществляют аналогично методу,описанному в примере 1. Ферменты выделяют из концентрата путем добавления сульфата аммония до коэффициентанасыщения 0,8 с таким расчетом, чтобы рН смеси был равен 3,8 (подкисление проводят 0,1 н. НзРО 4 до РН 1,8-2,3) . Далее выделение ферментов ведут аналогично способу, описанному впримере 1. Выход пектолитических ферментов в препарате по активности 95,2.П р и м е р 3. Культивирование микроорганизмов-продуцентов амилолитических ферментов осуществляют при оптимальных условиях в ферментере емкостьюб 050 м на питательной среде соответстзвующего состава. Ферментный растворосвобождаютот биомассы и концентриру.ют. Амилаэу выделяют из концентратапутем добавления сульфата аммония при 65 нативном перемешивании до коэффициента насыщения 0,7 с таким расчетом,чтобы рН смеси был равен 5,9 ( подкисление ферментного раствора проводят 0,1 н. НС 3 до рН 3,9-4,2). После растворения сульфата аммония смесь при перемешивании барботируют воздухом в количестве 0,1 объема на объем смеси в 1 мин. Образующуюся пену собирают и гасят механическим способом. Перемешивание и барботаж останавливают с прекращением пенообразования . После пеногашения из воздушной суспензии получают высококонцентрированный очищенный раствор амилазы. Из концентрата ферментный препарат выделяют лиофильной сушкой,Выход амилазы по активности в препарате 95. П р и м е р 4. Культивирование микроорганизмов - продуцентов щелочныхи нейтральных протеолитических ферментов осуществляют при оптимальных условиях в ферментерах емкостью50 м на питательной среде соответствующего состава,Ферментный раствор освобождают отбиомассы и концентрируют.Ферменты выделяют из концентратапутем растворения сульфата аммония вконцентрате до коэффициента насыщения0,7 с таким расчетом, чтобы рН смесибыл равен 6,5 (подкисление проводят1 н,СНСООН до рН 4,5-5,0).Смесь интенсивно перемешивают и после растворениясульфата аммония барботируют воздухомв количестве 0,1 объема на объем смесив 1 мин. Образующуюся пену собирают игасят силиконовым пеногасителем в кодичестве 0,002 к объему собираемойвоздушной суспензии. Перемешивание ибарботаж заканчивают с прекращениемпенообразования.После добавления пеногасителя из пены получают высококонцентрированный ферментный раствор,из которого выделяют препарат методомлиофильной сушки.Выход протеолитических ферментов впрепарате по активности 91.П р и м е р 5Культивирование микроорганизмов - продуцентов кислой протеазы осуществляют при оптимальных условиях в ферментере емкостью 65 м насреде соответствующего состава.Глубинную культуру отделяют от биомассы и ферментный раствор концентрируют. Кислую протеазу выделяют иэ концентрата путем добавления сульфата аммония до коэффициента насыщения 0,8 стаким расчетом, чтобы рН смеси былравен 5,5 (ферментный концентрат подщелачивают 10 КНЯЖОН до ьн 3,0-3,8).Смесь активно йеремешивают и послеполного растворения сульфата аммониябарботируют воздухом в количестве 0,15объема на объем смеси в 1 мин.516740 Формула изобретения 1.Способ выделенИя ферментов из жидких растворов, включающий вспенивание раствора путем пропуска через не - го воздуха, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью увеличения выходаферментов, перед вспениванием в раствор вводят сульфат аммония, полученную смесь перемешивают, а пену собирают и концентрируют2.Способ по и. 1, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что воздух подают на вспенивание в количестве 0,05-0,2 объема на объем смеси в 1 минтель Б.ВеличкоМ.Левицкая Корректор,А.Власенко Заказ 1626/138 Тираж 551. Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5филиал ППП Патентф, г.ужгорОд, ул.Проектная, 4 Образующуюся пену собирают и гасятсиликоновым пеногасителем в количестве 0,0015 от объема собираемой пены.Перемешивание и барботаж заканчивают с прекращением пенообразованияПосле добавления пеногасителя из пеныобразуется высококонцентрированныйочищенный ферментный раствор, из которого препарат выделяют методом лиофильной сушки,10Выход кислой протеазы по активности в препарате 96.П р и м е р 6. Культивирование микроорганизмов-продуцентов целлюлолитических ферментов осуществляют в ферментере емкостью 50 м при оптимальныхзусловиях на питательной среде соответствующего состава,Биомассу отделяют от культуральнойжидкости и ферментный раствор концентрируют. Выделение целлюлаз проводятиз концентрата путем добавления сульфата аммония до коэффициента насыщения0,85 с таким расчетом, чтобы РН смесибыл равен 3,95 (подкисление проводят0,25 н,НСГ до РН 2,0-2,5), Смесь активно перемешивают и после полногорастворения сульфата аммония барботируют воздухом из расчета 0,12 объемана объем смеси в 1 мин.Образующуюсяпену гасят силиконовым пеногасителем 30в количестве 0,001 к объему собираемой воздушной суспензии. Перемешиваниеи барботаж останавливают с прекращением пенообразования,После добавленияпеногасителя из пены образуется высококонцентрированный очищенный раствор,иэ которого ферментный препарат выделяют методом лиофильной сушки.Выход целлюлолитических ферментовв препарате по активности 96, 40П р и м е р 7. Поверхностное культивирование микроорганизмов - продуцентов пектолитических ферментов-осуществляют на среде соответствующегосостава при оптимальных условиях.Дляполучения ферментного раствора изкультуры проводят экстракцию ферментов водопроводной водой. Выделениепектиназ осуществляют из сконцентрированного экстракта путем добавленияк нему сульфата аммония до коэффициента насыщения 0,8 с таким расчетом,чтобы РН смеси был равен 4,5 ( подкисление концентрата осуществляют 0,15н,НРОф смесь активно перемешиваюти после полного растворения сульфатааммония барботируют воздухом из расСоставиРедактор Л.Гончарова Техред чета 0,05 объема на объем смеси в 1 мин.Образующуюся пену собирают и гасят механическим способом. Перемешивание и барботаж заканчивают с прекращением пенообразования . После гашения пены получают высококонцентрированный очищенный ферментный раствор пектолитических ферментов, из которого препарат выделяют методом лиофильной сушки.Выход пектолитических ферментов в препарате по активности 96.П р и м е р 8, Получение фермент- ного раствора пектолитических ферментов осуществляют аналогично методу, описанному в примере 7, Выделение пектолитических ферментов проводят из концентрата путем добавления к нему сульфата аммония до коэффициента насыщения 0,8 с таким расчетом, чтобы РН смеси был равен 3,8 (подкисление проводят 0,15 н, НзРО 4). Дальнейшее выделение пектолитических ферментов проводят по примеру 7.Выход пектолитических ферментов в препарате по активности составляет 94,8.Таким образом, предлагаемый способ получения ферментов в очищенном виде позволяет упростить технологическую схему выделения ферментов путем исключения стадий осаждения фермента, отделения осадка и длительной очистки его от сульфата аммония диализом. Время выделения фермента из концентрата сокращается приблизительно в 5 раэ; кроме того, обеспечивается повышение выхода фермента за счет сокращения потерь при осаждении и очистке фермента от примесей.