Способ получения стимулятора интерферопа

(32) 22.03,71 (33) Япония Государственный комитет Совета Министров СССР 43) Опублико(53) УДК 615,371(088.8 но 25.06.74, Бюллетень Ле 23 по делам изворетеннй и открытий(45) Дата опубликования описания 30.01.78 72) Автор изобретени Иностранец Ясукие Накасе(Япония) Иностранная фирма Китасато Институт71) Заявите 4) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТИМУЛЯТОРА ИНТЕРфЕРОН 2с 1 е 1 е 11 а рег 1 цяз в 1 фаз Изобретение относится к области медицины.Известен способ получения стимулятора интерферона из микроорганизмов путем выращивания их на жидкой или твердой питательной среде, выделения основных фракций дезинтеграфией, ультрафильтрацией и хроматографией.Целью предложенного изобретения является повышение активности препарата.Для достижения поставленной цели в качестве исходного сырья используют микроорганизмы типа Вогс 1 е 1 е 11 а рег 1 цвЬ в 1, 11 и 111 фазе развития.Г 1 р и мер 1. Микроорганизмы вида Вогйс 1 е 11 а рег 1 цяз в 111 фазе развития подвергают взбалтыванию прп 35 - 37 С в течение 72 часов в модифицированной культуральной среде Кохена-Вилера. После культивирования культуральную жидкость центрифугируют с получением 1,000 мл надосадочной жидкости, которую фильтруют в стерильных условиях, в результате чего получают 900 мл активной фракции А.Аналогичным образом получают 900 мл активной фракции В при использовании микроорганизма вида Воп 1 е 1 е 11 а рег 1 цяз во 11 фазе развития.Аналогичным образом получают 900 мл активной фракции С при использовании микроорганизма вида Вогеразвития.Вышеупомянутую активную фракцию Аконцентрируют до 50 мл, затем концентрат 5 подвергают очистке хроматографическим путем с применением дд.О-Сефадекса Ан получают 50 мл активной фракции. Аналогпчноц обраоотке подвергают активные фракции ЫиС.10 11 р имер 2. Микроорганизмы вида Вогйе(е 1 а рег 1 цяь в 111 фазе развития культивируют при 3 э - 37 С в течение 48 часов в угольно-агаровой среде. Затем 10 г микробных клеток сооирают и суспендируют в 100 мл в со левом фосфатном буферном растворе, полученную суспензию подвергают в течение 30 минут звуковой обработке (10 кгц) с целью измельчения микрооных клеток. Затем жидкость, содержащую измельченные микробные 20 клетки, центрифугируют, 90 мл верхнего слояжидкости оорабатывают хроматографическим путем с применением Сефадекса 0 1 оО, получают 40 мл активной фракции 0-1, Аналогично методике, приведенной выше, культивируют 25 микроорганизмы вида Вогде 1 е 11 а рег 1 цяз в111 фазе развития при 35 - 3 С в течение 72 часов, получая 40 мл активной фракции 0-2.Аналогичным образом получают 40 мл активной фракции Е с применением мпкроорга433688 низма вида Вогдесе)а рег(нз 1 з во 11 фазе развития.Описанным выше способом получают 40 мл активной фракции Р с применением микроорганизма вида Вогс 1 е 1 е 1 а регпз 18фазы развития, Затем жидкость, содержащую измельченные микробные клетки фазы 1, центрифугируют и получают верхний слой жидкости, которую затем подвергают хроматографической очистке с применением ДЭАЭ-целлюлозы в качестве адсорбента, в результате чего получают 30 мл активной фракции 6.Результаты изучения получения ннтерферона из активных фракций А - Сп, полученных по методикам примерови 2, приведены ниже со ссылкой на следующие сравнительные примеры,Сравнительный пример 1.Определение количества вырабатываемого интерферона (опыты 1 пИго) .Смешанный раствор, содержащий 1,4 объемных частей солевого фосфатн ого буферного раствора иобъемную часть раствора РинТаблица 1 Оценка вырабатываемости интерферона (в опытах 1 п чИго) Титр интерферона Концентрация образца Образец Клетки селезенки80 220 220 85 700 680 330 310 330 100 430 340 230 500 360 205 50 280 220 230 220 85 320 300 100-кратное1000-кратное 106 320 160 930 20- кратное100-кратное 500-кратное Содержит 10 мг твердых частиц на 1 мл(необработанный) Обработанный при 56 С в течение 30 мин 17 52 72 240 1400 1900 10-кратное разбавление жидкости, содержащей 45 мг твердых частиц на 1 мл720 630 1900 50-кратное разбавление указанной жидкости 250-кратное разбавление указанной жидкости230 1. Фаза П 1 микроорганизма Вогце 1 е 11 а рег 1 нз(з 1) Верхний слой культуральной жидкости (активная фракция) 2) Верхний слой измельченных микробныхклеток, 48-часовая культура (активнаяфракция Р - 1) 3 Верхний слой измельченных микробныхклеток, 72-часовая культура (активнаяфракция 0 - 2) 2. Фаза П микроорганизма Вогйеге 11 а рег 1 из(з1 Верхний слой культуральной жидкости, 72-часовая культура (активная фракция В) 2 Верхний слой культуральной жидкости, 48-часовая культура (активная фракция Е) 3, фаза 1 микроорганизма Вогпе 1 е 11 а рег 1 цз 1 з1) Верхний слой культуральной жидкости(активная фракция С)2 Верхний жидкий слой измельченныхмикробных клеток (актпвная фракция Г) 3 Некротоксин (активная фракция О) гера, смешивают с 0,6 объемными частями телячьей сыворотки, полученную смесь сме.шивают с 3 объемными частями дистиллированной воды с получением гипотонич еского 5 раствора, Каждую из активных фракций А - (.разбавляют указанным гипотоническим раствором до различных концентраций с получением разбавленных образцов. С другой стороны приготовляют клеточную суспензию таким 10 образом, чтобы ткани селезенки и лимфатических узлов кролика весом 500 - 1000 г, убитого проколом в сердце, были разорваны с помощью пинцета, и полученные клетки суспсндируют в культуральной среде до концен трации 5 1 О клеток на одну чашку (для селезенки и лимфатических узлов), Затем каждый из вышеуказанных разбавленных образцов смешивают с вышеупомянутой клеточной суспензией и культивируют при 25 С в течение 20 24 часов, культуральную жидкость центрифугируют с получением верхнего слоя жидкости, который затем подвергают оценке на вырабатываемость интерферона. Полученные результаты приведены в таблице 1.433688 Титр интерферона выражается в отношении наивысшего разбавления, вызывающего 50% ингибирование количества и размеров кровяных пластинок по сравнению с контролем. Сравнительный пример 2.Оценка вырабатываемости интерферона (в опытах 1 п стого).Каждый из разбавленных образцов, полученных по методике сравнительного примера Таблица 2 Оценка вырабатываемости интерферона (в опытах 1 п ч 11 го) Титр интерферона Номеркролика Образец Концентрация образца через2 часа через 5 часовРазбавление10-кратное 490 1800 50210 20-кратное100-кратное500-кратноеСодержит 10 мгтвердых частиц на 1 мл(необработанный)Обработанный при56 С в течение 30 мин 340 40 43 менее 10 Предмет изобретения Способ получения стимулятора интерферона из микроорганизмов путем выращивания их на твердой или жидкой питательной среде с последующей дезинтеграцией, ультрафильтраСоставитель С. 1 Ценева Техред Р. ЮсуповаРедактор Н. Белявская Корректор А. Степанова Заказ 199/14 Изд,165 Тираж 451 НПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4,5Подписное Типография, пр. Сапунова, 2 1. Фаза 111 микроорганизма Вогй. рег. Верхний слой культуральной жидкости (активная фракция А) 2, фаза 1 микроорганизма Вогб. рег, 1 Верхний слой культуральной жидкости (активная фракция С) 2 Верхний слой измельченных микробныхклеток (активная фракция Р) 3 Некротоксин (активная фракция О) 1, вводят в дозировке 0,5 мл путем внутривенного введения кроликам весом от 500 до 1000 г. На 2-й и 5-й час после инъекции отбирают по 3 мл крови у каждого кролика по средством прокола сердца, и сыворотку, выделенную из указанной крови, подвергают оценке на вы раб атываем ость интер ферона, аналогично методике сравнительного примера 1. Полученные результаты приведены в таб лице 2. 15 цией и хроматографией, отл и ч а ющ и й с ятем, что, с целью увеличения активности препарата, в качестве исходного сырья используют микроорганизмы типа Вогсе 1 е 11 а регцз 1 з в 1, 11 и 111 фазе развития.20