Способ получения сложных эфиров нуклеозиддифосфата

К ПАТЕН а У висимый от пате аМ. Кл. С 07 д 51/5 Заявл1721408/23-4)Р 2059429.0, ФР о 02.Х 11.1971 ет 02,Х 11,197 Прн ооударстааииый комитатСовета Иииистроа СССРпа далем иаобратаиийи отироаий УДК 547.857.7.07(088.8) овано 21,Х 1,1973, Бюллетень46публикования описания 11 Л 1.1974 Дага Авторызобретени Иностранцы Ханс Ульрих Бергмейер едеративная Республика Германии),Михаель Нельбек-Хохштеттер(Австрия) Гюнтер Вейманн и Эрих Хайд Федеративная Республика Германии) Иностранная фирма Берингер Маннхайм ГмбХ Федеративная Республика Германии)Заявител ОЛУЧЕНИЯ СЛОЖНЫХ ЭФИРОВУКЛ ЕОЗИДДИФОСФАТА ПОСОБ Изобретение относится к способу получениясоединений, которые могут найти применениев фармацевтической промышленности,Известен способ получения сложных эфировнуклеозиддифосфата путем взаимодействия 5нуклеозидфосфата с эфиром фосфорной кислоты в присутствии дициклогексилкарбодиимида в пнридине или формамиде как растворителе.Однако этот способ характеризуется большой продолжительностью реакции (7 дней),многочисленными побочными продуктами инеудовлетворительным выходом (менее 454),Предлагаемый способ заключается в том,что метапольный 1)аствор пуклсозидмонофосфорной кислоты и дициклогсксилкарбодиимида, содержащий агент растворения, подверга 10 т ВзаимодеЙстви 10 путем медле 1 шОГО добав.ления, например по каплям, кислого метанольного раствора эфира фосфорной кислоты с последующим выделением целевого продукта известным спосооом. Реакцшо обычно проводятпри тсмпературс от 0 до 80"С, преимущественно при комнатной тсмпературс. в течение нескольких часов с выходом до 900 и гыше, В качестве нуклеозидмонофосфорной кислоты используют, как природные, так и синтетические нуклеозиды. В качестве второй компоненты применяется эфир фосфорной кислоты. При этом фосфорная кислота может быть этерифицирована при помощи какого-нибудь соответствующего, содержащего гидроксильные группы органического соединения; предполагается, что этот эфир фосфорной кислоты достаточно растворим в примененном согласно изобретению растворителе, Примерами органических соединений, которые могут применяться в форме их эфиров фосфорной кислоты, являются одно- и многоатомные спирты н аминоспирты, например, этаноламин, холин, сахар, например глюкоза, манноза, галактоза, рибоза, глицериновый альдегпд, а также соответствующие кетозы и аминосахар, Предпочтительными эфирами фосфорной кислоты явлгпотся холинфосфат, этанолампнфосфорная кислота, глюкоза 1-фосфат, глюкоза-б-фосфат, галактоза-фосфат и манноза-фосфат, глюкозамии-фосфат, галактозамин-фосфат идругие, маннозамин-фосфат и соответствую. щие И-ацетилсоединения.В качестве растворителя применяется метанол. Метанол может частично заменяться алканоламп с четырьмя атомами углерода или низшими диалкилкетонами с тремя угле- родными атомами на одну алкильную цепь или диметилформамидом. Однако выход в результате этого ухудшается. Особенно хорошие результаты получают в присутствии растворителя, Соответствующими растворителями являются, например, пиперидин, циклогексиламин и анилин, а также преимущественно морфолпн. Метанольный раствор эфира фосфорной кислоты обычно должен иметь рН от 1,0 до 6,5, предпочтительно от 4,0 до 5,0. В качестве кислоты для регулирования величины рН в требуемой области могут использоваться как неорганические, так и органические кислоты, которые растворимы в примененном растворителе, Предпочитают галогеноводородные кислоты, особенно хлористоводородную кислоту. Вследствие того, что при способе изобретения допустимо применение воды, могут применяться кислоты в виде водного раствора, например концентрированная соляная кислота. Подходящими кислотами являются такие, которые не ведут к осаждению компоненты реакции или дают с последней необратимую реакцию (например, серная кислота, азотная кислота), Эфиры фосфорной кислоты могут применяться в форме их солей, например, щелочных и щелочно-земельных металлов, предпочтительно солей кальция, Предполагается, что ионы кальция при этом способствуют растворению. Однако оказались пригодными также соли натрия, калия, лития, стронция, магния и бария и соли органических аминов. Могут применяться также смешанные соли кальция, например смешанные соли с галогеноводородными кислотами, как, например, хлористый холинфосфаткальций,П р и м е р 1. 10 г уридин-монофосфата (У-МФ) в виде свободной кислоты (около 30 ммоль) растворяют в 500 мл чистого метанола, добавляют 7,5 мл морфолина и нагревают, после добавления 10 г дициклогексилкарбодиимида до 50 С, К этому раствору медленно добавляют по каплям 90 ммоль глюкоза-фосфата в виде соли морфолина, растворенной в 500 мл метанола с рН 4,0, Через 12 - 15 час. реакции при 50 "С добавляют при хорошем перемешивании 500 мл изопропанола, осажденный осадок отделяют центрифугпрованием, растворяют в 250 мл воды, нейтрализуют, подают на колонну 1 МАС-А(объемом 500 мл, в форме формиата) и вымывают с линейным градиентом 0 - 0,5 и. формиата аммония с рН 4. Фракции с УДФ-глюкозой, которые поступают с колонны при содержании 0,4 н, формиата аммония, сразу обессоливают на колонне с углем объемом 2 л. Вымывание угля производят смесью изопропанола: Н О: : едкого натра = 50; 50: 0,5. Элюаты доводят при помощи натриевой щелочи до величины 510 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 рН 7,2, раствор концентрируют в вакууме и натриевую соль УДФ-глюкозы осаждаю г 10-кратным объемом метанола.Выход: 8,5 - 9 г (около 50 теории, в пересчете на исходный У=5=МФ).Аналогично получают соответствующую УДФ-галактозу при помощи галактозы-фосфата, соли морфолина.Пример 2. 15 г галактозыфосфата, соли морфолина, растворяют в 500 мл метанола, и добавлением концентрированной соляной кислоты величину рН раствора доводят до 4. Этот раствор медленно добавляют по каплям к 200 мл метанольного раствора с температу. рой 50 С, который содержит 5 г аденозин. монофосфата (А-МФ) в виде свободной кислоты, 3,5 мл морфолина и 5 г дпциклогексилкарбодиимида. После 15 час, реакции при 50 С, при величине рН 4 - 4,5 добавляют при хорошем перемешнванпи 250 мл изопропанола, Осажденный осадок отделяют центрифугпрованием, растворяют в 200 мл дистиллированной воды, устанавливают величину рН и, наконец, поглощают на колонне с анионообмен. ной смолой (объем 500 мл, тип Дауэкс 1 Х 2, в форме формиата). Продукт элюируют 0,7 н. раствором формиата натрия и обрабатывают дальше углем, как в примере 1.Выход АДФ-галактозы, соли натрия, составляет 4,5 г (около 50/, теории в пересчете на введенный А-МФ) .Пр имер 3. 14,5 г. этаноламинофосфорной кислоты (около 100 ммоль) и 15 г хлористого кальция (СаС 1 2 Н О) растворяют в 55 мл дистиллированной воды, подкисляют приблизительно 5 мл концентрированной соляной кислоты и объем доводят метанолом до 500 мл. Полученный раствор медленно добавляют по каплям к горячему раствору метанола (250 мл) с температурой 50 С, который содержит 11 г цитидин-монофосфата (Ц-МФ) в виде свободной кислоты, 8 мл морфолина и 11 г дициклогексилкарбодиимида, Приблизительно через 15 час. реакции при 50 С добавляют 300 мл изопропанола, осадок отфильтровывают, растворяют в воде, нейтрализуют и хроматографируют на колонне с анионообменной смолой (типа Дауэкс 1 Х 2, в форме формиата, 50 - 100 меш, объем 1000 мл). После предварительной промывки при помощи 0,02 н, муравьиной кислоты, элюируют ЦДФ-этаноламин. Полученную фракцию концентрируют, нейтрализуют едким натром и, наконец, кристаллизуют добавлением этанола, Кристаллы промывают этанолом и сушат.Выход: около 12 г (70 теории в пересчете на введенный Ц.МФ).П р и м е р 4, 2 г цитидинфосфорной кислоты растворяют в 100 мл чистого метанола, добавив 1,5 мл морфолина, и, после добавления 2 г дициклогексилкарбодиимида, нагревают приблизительно до 50 С. К полученному раствору медленно добавляют по каплям раствор из 5 г холинфосфата - хлористого кальция в 175 мл метанола, который содер407449 Составитель В. ЖестксвТекред Е, Борисова Корректор Е. Сапунова Редактор Л, Струве Заказ 712/0 Изд.1027 Тирани 511 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совста Министров СССР по делам изобретений и открытий Москва, Ж, Раушская иаб., д. 4,5Типография, пр, Сапунова, 2 Бжит 2,0 мл 36;4-ной соляной кислоты. Через 12 - 15 час. реакции при 50 С добавля)от при хорошем перемешивании 250 мл изопропанола. Осажденный осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 200 мл дистиллированной воды и в виде формиата подают на хроматографическу 1 о колонну с 250 мл анионообменной смолы Дауэкс 1 Х 2. Колонну промывают 500 мл дистиллированной воды и элюируют посредством 0,05 н. муравьиной кислоты, Содержащие цитидпндифосфатхолин фракции концентрируют досуха, растворяют в небольшом количестве воды, нейтрализуют натрпевой щелочью и кристаллизуют добавкой этанола.Выход: 3,2 г цитидиндифосфатхолина - Ха 4 Н О 190 с 1 о теории),П р и м е р 5, 5 г гуанидин-.;онофосфата в виде свободной кислоты, растворяют в 100 мл дистиллированной Н О и 5 мл морфолина и концентрируют приблизительно до 15 мл. К маслянистому концентрату добавляют 100 мл метанола, 2 мл морфолина н 8 г дициклогексилкарбодиимнда, При слабом перемешнвании в реакционпу 1 о смесь медленно добавляют по каплям при 50 - 55 С раствор из 15 г глюкозы-фосфата, соли морфолина, в 500 мл метанола при рН 4,0. По окончании добавления раствора величину рН устанавливают при помощи концентрированной НС 1 до 4,5. Через 10 - 15 час. при рН 4,5 реакция заканчивается, Реакционный раствор концентрируют в вакууме приблизительно до 200 мл, и полученную гуанозиндифосфат-глюкозу осаждают добавлением 400 мл изопропанола.Осадок растворяют в НаО, нейтрализуют и очищают, как описано в примере 1, на колонне 1 МЛС-Л, угольную кислоту обессолпвают и 5 осаждают метанолом.Выход: 3,5 г 140 с/о теории) ГДФ-глюкозы Хаа,Предмет изобретения101. Способ получения сложных эфпроьнуклеозиддифосфата реакцией нуклеозндфосфата с эфиром фосфорной кислоты в присутствии дппиклогекснл кар боднимида с после дующим выделением целевого продукта известным способом, о т л н ч а ю ш, и й с я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и упрощения процесса, метанольный раствор нуклеозидмонофосфорной кислоты и 20 дицшлогекснлкарбодипмпда, содержащийагент растворения, медленно добавляют к кислому метанольному раствору эфира фосфорной кислоты, пмшощему величину рН от 1 до 6,5.25 2. Способ по и. 1, отличающийся тем,что реакцию проводят прп температуре от 0 до 80 С.3. Спосоо по п, 1, отл нч а ищи й с я тем,что в качестве агента растворения нсполь зуют морфолнн.4. Способ по п, 1, отл пч а ю щи йся тем,то эфир )осфорной кислоты вдят в реакцию в виде соли щелочного нлп щелочно- земельного металла, например соли кальция,