Способ определения механических повреждений криоконсервированных клеток

(19 05 6 01 М 33/48 ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕВЕДОМСТВО СССР(ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ биологии и кри нко и В.А.М оСС 8, 198 НИЯ М КРИО АН НСЕ к крио о для о ологии ределеИзобре и может бь ния повреж ровании,Целью ние достов ских повре клеток.(71) Институт проблем криоомедицины АН УССР(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕЧЕСКИХ ПОВРЕЖДЕНИЙВИРОВАННЫХ КЛЕТОК(57) Изобретение относитсяи может быть использован тение относится к криобиологии ть использовано для определедения клеток при криоконсервиизобретения является повышерности определения механичеждений криоконсервированных особ поясняется следующим прим В сосуд заливают исследуемую суспензию, погружают в термостат и проводяттепловую обработку (охлаждение, нагрев), При возникновении в материале импульсных электрических полей на зонде наводится импульсная ЭДС за счет емкостной связи с теми участками образца, где возникает электрическое поле. Импульсы усиливаются усилителем и регистрируются с помощью регистрирующего устройства. Подавая от генератора импульсы стандартной амплитуды и длительности, перед каждым экспериментом производят калибровку системы ния механических повреждении криоконсервированных клеток. Цель изобретения - повышениедостоверности определения механических повреждений криоконсервированных клеток, Сущность изобретения: в процессе криоконсервирования регистрируют электрические импульсы, возникающие при механических повреждениях клеток, Пол ожител ьн ы й эффект. Изобретение позволяет непосредственно в образце регистрировать импульсные электрические поля при тепловом воздействии, повысить достоверность определения за счет регистрации электрических импульсов в среде нахождения биообьектов,регистрации (усилителя и регистрирующего устройства). Для этого измеряют амплитуду стандартного импульса с помощью регистрирующего устройства и с этими показателями сравнивают импульсы, регистрируемые при тепловой обработке исследуемого материала. Такой способ регистрации позволяет сопоставлять между собой электрические импульсы в разных образцах или при разных условиях тепловой обработки,Способ проверяли на экспериментальной установке, которая предназначена для исследования веществ, находящихся в исходном жидком состоянии при комнатной температуре, с последующим охлаждением до - 196 С и нагревом. Тонкостенный стакан (толщина стенок 0,1 мм, диаметр 28 мм, длина 70 мм, из нержавеющей стали предназначен для заливки исследуемой жидкости. Для охлаждения образца стакан погружают в сосуд с жидким азотом, Погруженный в раствор зонд представляет собой отрезокпровода во фторопластовой изоляции типа МГГФ - 1, длиной 20 мм. Провод погружен в образец изолированной частью, а концы провода находятся над поверхностью жидкости, Таким образом обеспечивается изоляция зонда от жидкости по постоянному току. Зонд соединен с усилителем импульсов, собранным на микросхеме К 284 УЕ 1 А. Усиленные сигналы подаются на осциллограф типа С 1 - 65 А, Зонд соединен также через конденсатор емкостью 1 пф с импульсным генератором типа Г 5 - 56. На стенке имеется насадка, в которой расположен термометр сопротивления и нагреватель, соединенные с блоком регулировки и измерения температуры, Импульсные сигналы с выхода усилителя подаются на вход осциллографа и на вход(подсвет), Развертка по оси выполнена по температуре образца. Для этого напряжение, пропорциональное температуре образца, подается на вход осциллографа. Имеется еще одна цепь регистрации записи огибающей импульсных сигналов, состоящая из усилителя импульсов типа УЗ - 29, интегрирующей ВС-цепочки и самопишущего потенциометра типа КСП - 4.5 мл донорской крови человека, стабилизированной гемоконсервантом ЦОЛИПК - 7 б, центрифугировали, отделяли плазму. Полученную эритромассу смешивали в соотношении 1:1 с криоконсервантом на основе 1,2 - пропандиола (35 Д 1,2 - ПД, 3 сахарозы 0,7 о МаС 1). 1 мл этой смеси помещали в стакан 1 и охлаждали до - 196 С погружением в жидкий азот. Скорость охлаждения составляла 100/мин, нагрева - 70/мин, В температурном диапазоне от - 110 С до - 164 С, т.е. оттемпературы стеклования криозащитного состава, на осциллографе наблюдали импульсные сигналы зонда, возникающие в момент образования электрических зарядов в процессе механических разрушений твердоаморфной матрицы.Отмечено, что электрические сигналы возникают при стекловании жидких микрофаз и длятся в определенном температурном интервале за счет градиентатемпературДоказательством того факта, что повреждения биологических объектов в суспензии при низких температурах и возникновение электрических импульсов в них явления взаимосвязанные, могут служить результаты следующего примера, Эритроциты, приготовленные по выше описанной методике, смешивали с пропандиосахаролем (ПДС) в соотношении 1:1 на основе глицерина (60 масглицерина, 40 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 мас., Н 20) в отношении 2;1, т.е, две части эритромассы смешивали с одной частью раствора глицерина, Криозащитные среды выбирали таким образом, чтобы наличие электрических импульсов в них в температурном диапазоне тц - 196 С существенно отличалось. 1 мл полученной смеси помещали в стакан 1 и охлаждали до - 196 С, затем нагревали до температуры стеклования, и снова охлаждали до - 196 С. Циклирование в температурном интервале т 9 - 196 С проводили до 20 раз, Температура стеклования для суспензии эритроцитов с ПДС составляли - 110 С, а для суспензии эритроцитов с раствором глицерина -- 108 С. После размораживания в водяной бане (+45 С) образцы центрифугировали, определяли свободный гемоглобин в надосадке. При температурном циклирования эритромассы в присутствии ПДС зарегистрировано существенно меньше электрических импульсов, что в таком же эксперименте, но криопротектором служил водный раствор глицерина, Как видно из результатов, с ростом количества циклов охлаждения и нагрева в температурной зоне 194 - 196 С увеличивается содержание свободного гемоглобина в надосадке, т,е. растет гемолиз, Этот факт как раз и указывает на повреждение эритроцитов в результате термического воздействия. Гемолиз эритроцитов в криозащитном растворе с глицерином нарастает быстрее, чем в криозащитном растворе с ПДС, Отличия в количестве зарегистрированных электрических импульсов коррелирует с данными по гемолизу. Такие же импульсы мы наблюдали в расторах криопротекторов тех же концентраций, какие получились в приведенных выше примерах, после смешения криозащитных сред с эритромассой. При этом импульсы возникали в растворах криопротекторов в тех же температурных интервалах, что и в суспензиях эритроцитов с добавками криопротекторов вблизи температуры стеклования.Отсюда можно сделать вывод, что в застеклованн ых микроучастках эритромассы возникают растрескивания, вызывающие электрические поля, которые затем наводят сигналы на зонде. Именно в этом же диапазоне температур возникают повреждения, что видно по нарастанию гемолиза. Таким образом, из всей совокупности механических повреждений, в отличие от прототипа, мы выделили только те, которые приводят к повреждению клеток в области низких температур.1827626 формула изобретения 15 20 25 30 35 40 45 50 Составитель Л.фоменкоТехред М.Моргентал Корректор М.Андрушенко Редактор Заказ 2357 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Ра шская наб., 4/5 У Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101Таким образом, заявляемый способ позволяет непосредственно в образце регистрировать импульсные электрические поля при тепловом воздействии, повысить достоверность определения механических повреждений при криоконсервировании биологических суспензий за счет регистрации растрескиваний в среде нахождения биообъектов. Способ определения механических повреждений криоконсервированных клеток 5 путем регистрации физических параметров,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения достоверности определения, регистрируют возникновение электрических импульсов в суспензии клеток, 10