Способ определения функциональной зрелости иммунной системы телят

СОЮЭ СОВЕТСКИХ СОЦИДЛИСТИЧЕСКИ РЕСПУБЛИК(515 С 01 К 33/ ОСУДАРСТ БЕ ННЫЙПО ИЗОБРЕТЕИИЯМПРИ ГКНТ СССР ОМИТЕТОТКРЫТИЯМ/ СА К АВТОРС У. СВИ,ЦЕТЕЛЬС зиолог свидетельство ССС6 01 К 33/53, 198 дольке, учитывают читывают диагнопен х исован им- ном иоого имци- Ю В(46) 07.06,92, Бюл, М. 29 71) Институт зоологии иАН МССР72) Е,В.Баева56) Авторскоеф 1422153, кл. 54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУН КЦИОАЛБНОЙ ЗРЕЛОСТИ ИММУННОЙ СИСЕМЫ ТЕЛЯТ Изобретение относится к иммунофизиологии и может быть использовано в ветеринарной иммунологии для опоеделения функциональной зрелости иммунной системы жлвотных.Существующие методики определения состояния иммунной системы животных не учитывают понятие ВозрастнОй нормы, При рождении у млекопитающих иммунная система еще функционально не созрела, поэтому показатели, которые свидетельствуют о наличии патологии у взрослых, являются нормальными для новорожденных живо" тных и наоборот. В практическом животноводстве важной является идентификация возрастной нормы" ,так как выращивание животных в условиях промышленных технологий способствует рождению функционально незрелого потомства, которое подвержено инжекциям и относится к группе риска.Известен способ определения иммуно- дифицитнОГО состояния, сОГласно которому оп редел я ют обьемное содера ние паренхимы тимуса стереометрическим методой;(57) Использование: иммунофизиология, ветеринарная иммунология. Сущность изобретения: определяют синтез ДНК в мононуклеарах периферической крови по включению Н-тимидина в культуру лимфо 3циов периферической крови, при этом его значение в пределах 1600-2800 имп,/мин соответствует функционально зрелой иммунной системы, 2 табл. числа тимических телец ввозраста пациента и рассстические показатели,Однако, данный способ легкодоступри проведении патологоанатомическиследований и не может быть испольэдля прижизн 8 нной ОЦ 8 нки сОстОяниямунной системы в раннем постнательОНТОГЕНВЭЕ,Цель изобретения - повышение радлогичности способа эа счет прижиэненнопределения функциональной зрелостимунной системы телят,Цель достигается определением спонтанного синтеза ДНК в культуре лимфатов периферической крови по включенимолекулу Н-тимидина,Способ осуществляется следующим образом,Определение спонтанного синтеза ДНКв мононуклеарах периферической ро(МПК) у новорожденных телят состоит иэнескольких этапов, включающих;Культивирование клеток,Дл я кул ьти Ви рован ил М П К испол ьзует- СЯ ПИтатЕПЬНаЯ СРЕДа СЛЕДУЮЩЕГО СОСтаяа, среда Игла с 1000 мг/л бикарбоцата натрия 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицица, 2 мкг/мл глутамина, 5,ь Эмбриональной телячьей сыворотки.После разбавления клеток питательной средой гю 20 мкл клеточной суспензии помегцают в плексиглассовые планшеты с луцками и ицкубнру 10 г В течение 72 ч при 37 С.Подсчет ицте 51 си 17 ности, синтеза ДН К, За 4 ч до Окоцчаци 51 /2-чэсОВГЙ инкубаци 11 к"пьт)у МПК в культуральную среду добавля 1 от 1-1-тимидин в молярной активности 15 мКи, мл, После окончания инкубации клеток, суспензии переносятся на мел 1 бранные фильтры, пр 0111-,18810 т холОД- ной Т;(У, фиксирук 7 т в зтаноле и освоосжда 10 тся От Остатков воды В смеси зтэнол-Эфир, Фильтры помещают в радиационные виалы и заливают 10 мл сци 11 тилл 51 ционцоЙ жидкости. Радиоактивность кислотоцерастворимой фракцли подсч 11 тывают на сцлнтилляционном бетаспектрометре. Оценка результатов,Результат учитыва 1 от по вкл 1 очени 1 о Н-тимидица в МПК, выража 1 ощийся в имп lмиц 11 Э 10 клетокКак показал ретроспективный анализ заболеваемость животных после рождения зависит от.понгацного синтеза ДНК в МПК, Дац н ые представлен ы в табл, 1.ДОКЭЗЭТЕЛЬСТВОМ ТОГО, Что ВЫСОКИЙ ИЛИ низкий спонтанный синтез ДНК в МП( но- ВОРО 1(ДЕН 1 Ц 1 Х ТЕЛЯТ ЯВЛЯЕТСЯ П 7 ИЗНЭКОМ Н 8- достаточно созревшей иммунной системы 50 получение суспензии МПК, культивирование клеток, подсчет ицтенсивности синтеза ДНК, оценка. результатов,Получение суспензии МПК,Суспензи 1 о МПК получа 1 от путем одцо- ступецчэтОГО центифуги 70 вания Гепзпицизированной 40 ед/мл) крови в градиенте плотности фиколл-верографин плотность Гэди 8 цта 1,071, приГОтовлецнОГО на 7 астворе Хеикса без добавления индикатора), Температура градиента +8-10 ОС, Само це 1- трифугироваиие желательно проводить в рефрижераторной центрифуге при 1500 Об,Ъин В гече 11 ие 0 ми 1 Ь Полученные моцонуклеэры Отмыва 10 т От Градиента дважды охлажденной средой 199. Кизцеспособность клеток Оцци(1 аетс 51 трипэ 1(овым синим и должна состэв 111 тть 90-95%. Клеточную взвесь разбавля 1 от культурэльной средой, доводя концентрацию клеток до 1-5 х 10 кл/мл,б явля 1 отся данные о времени становления других показателей иммунной системы, приведенных в табл, 2.5 Г р и м е р 1. Уноворокденцо 1 о теленкав стерильную пробирку с гепари 11011 берут 5МЛ КРОВИ,До проведения исследований до 5-8 ч)прОбирка с к 70 вь 10 хзэнитсЯ В холодильни 10 ке. Центрифугированием в одноступенчатом гггадиеяте фиколлверографин получа 1 отсуспецзию УПК, отмыва 1 от клетки в холодной среде 199,Оц 8 нивается жизнеспособность клеток15 трипановым синимх 10 клеток добавляютгВ планшеты с ОбОГЭ 1 цецной питательнойсредой,летки ицкубиру 10 т в тече 11 ие 72 чпри 37 С, За 4 ч до окончания инкубациидобавляют ВН тимидин, После Окончания20 инкубации клетки осакда 1 от на мембранныефильтры, промыва 1 от и подсчитыва;от радиоактивность кйслото 11 ераствоимойф 17 акции,Если показатели синтеза ДНК в МПК25 1600-2800 имп,/мин, теленок родился с иммуццОл системоЙ, соответству 10 щей данному периоду его развития,Если показатели выше или что хуже)ниже, то иммунная система животного фун 30 кциоцально незрела и теленок подверженинфекциям, его относят к гоуппе риска,Способ позволяет проводить раннююдиффаренциаци:а животных по степенизрегости иммунной системы, что дает Воз 35 мокность целенаправлен;1 о проводитьпрофилактические мероприятия, выявитьгруппы риска и прогнозировать состояниездоровья поголовья,Число ложно-полокительных определе 40 ний 19%; ложно-отрицательнь 1 х 14%,Формула изобретенияСпособ определения функциональнойзрелости иммунной сис.гемы телят путем исследования образца ткани с последующим выявлением оценочного показателя, о т л ич а 1 о щ и й с я тем, что, с целью повышения физиологи 1 ности способа за счет прижизненного определения функциональной зрелости иммунной 1;истемы, в качестве образца ткани исследуют фракци 1 о лимфо.цитов периферической крови, при зтом проВодЯт инкубэцию лимфоцитов В течение 72 ч в присутствии Н-тимидина с молярной активностью 15 МКи/мл, который добавля 1 от к кле 7 кам за 4 ч до окончания ицкубации, затем осажда 1 от на мембранные фильтры, ОбОэбатывэют трихлоруксусн(7 Й кислотоЙ, измеря 1 ог радиактивность кислотснерастворимой фракции и пуи ее значении 1600- функциональную зрелость иммунной систе 2820 имп/мин на 10 клеток определяют мы телят. Таблица 1 Спонтанный синтез ДНК в МПК, имп/мин Группы животных 958 + 86 2209 й 310770-1150 1600-2800 3200-4600 2800-3850 400-650 Таблица оказэт ень Т-л ень В-л арош Составитель Е,Баева Техред М,Моргентал рректо едактор Н,Х каз 2766 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКН .113035. Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгоро гарина, 101 Половозрелые КРС Новорожденные телята, незаболевший Новорожденные телята, впоследствие чере 5 - 7 дн) заболевшие гастрознтеритом Новорожденные телята, впоследствие заб левшие ОРЗ Новорожденные телята, впоследствие заб левшие бронхопневмонией 3986 + 3523265 + 259 580 + 65