Способ определения адгезивности тромбоцитов

(19) 01 й 33 /53 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН СВИДЕТЕЛЬСТВУ К АВТОРСКО адгезивности тромбоцитов путем подсчета относительного количества их в плазме до и после пропускания ее через коллагеновый пористый материал, содержащий в своем составе 0,5-0,250 аденозиндифосфорный кислоты, Различия в индексе адгезивности здоровых и боль ых людей позволяет определить их функциональную неполноценность, а также дает объективную величину активности разл 11 чных антиагрегантов и лекарственных средств. Способ позволяет определять адгезивность тромбоцитов в тромбоцитопенической плазме в условиях клиники, не прибегая к их выделению и концентрированию. Способ позволяет дифференцировать активные и неактивные тромбоциты при их дефиците в случае тромбоцитопении.(56) Лабораторныклинике;ред.проф.В.В,Мен1987, с,152. нский инстит Л.П.Истранов, ,В,Истранова и сследик е методы Справоч ьшикова ования в под едицина,(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕННОСТИ ТРОМБОЦИТОВ(57) Изобретение относитсяможет быть использовано дл АДГЕЗИВмедицине определен цине, в иональет притвления этого т ови и инфузио й непрерывно ие исследуемой еклянными оссбл является кении интактно через колонку срнлипания тро еста нужно 2 нный насос, е равномеркрови по кошариками.также и то, й тромбоцио стекляннымбоцитов не аст ой меня пато льна онтрона фуняз О 1 Я ,О Известен способ определения адгезиви тромбоцитов в условиях клиники, эачающийся в подсчете количества боцитов в цитратной крови до и после ускания ее через попихлорвиниловую ку, заполненную мелкими стеклянными иками. Расчет индекса адгезивности боцитов представляет собой выражен- в процентах отношение количества боцитов, задержавшихся на стекляншариках к исходному количеству тромтов в крови. то обеспечение возия тромбоцитарной тельным достиженивозможна стандартромбоцитов в метить, ч едован я значи ри этом ичества ност клю тром проп труб шар тром ное тром ных боци зобретение относится к меди ости к способам оценки функц ктивности тромбоцитов, и мож ься для диагностики функцио огии тромбоцитов, а также для действием лекарств, влияющих альную активность тромбоцит Для осущес мл цитарной кр обеспечивающи ное продвижен лонке со ст Недостатком сп что при пропус тарной плазмы ми шариками п происходит.Целью изоб ние чувствитель ние способа, определения ад плазме,Следует от можности иссл плазмы являетс ем, поскольку и тизация кол ретения является повыше- ности, упрощение и ускорен также возможность геэиености тромбоцитов в10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 исследуемом образец, что повышает достоверность определения путем разделения тромбоцитарной плазмы человека его же быстротромбоцитарной плазмой до стандартного количества, например, 100000 или 200000 тромбоцитов в 1 мкл и устраняется возможное влияние других клеток крови (эритроцитов, лейкоцитов), на адгезивность тромбоцитов,Укаэанная цель достигается тем, что в качестве материала, с которым взаимодействуют тромбоциты, сохраняющие хотя бы минимальную способность к адгезии, используют коллагеновый материал, содержащий АДФ (аденозиндифосфорная кислота), при соотношении коллаген-АДФ (мас.%), (99,5-99,75) - (0,5-0,25),Способ осуществляют следующим образом.Из коллагенового материала вырезают цилиндрический кусочек толщиной 5-7 мм и диаметром 5-7 мм, который вставляют в пластиковый наконечник стандартной автоматической лабораторной пипетки на 200-500 мл и опускают его в пластиковую пробирку соответствующих размеров (для сбора профильтрованной плазмы). После этого из исследуемой тромбоцитарной плазмы берут пробу для подсчета исходного количества тромбоцитов, а затем 200-400 мкл тромбоцитарной плазмы вносят в наконечник с коллагеновым материалом, после чего наконечник присоединяют к пипетке и нажатием колпачка пропускают плазму через коллагеновую губку. Пропущенную плазму встряхивают и отбирают от нее пробу для подсчета количества тромбоцитов, По результатам подсчета тромбоцитов в плазме до и после прохождения ее через коллагеновый материал, рассчитывают как обычно индекс адгезивности тромбоцитов,Для целей диагностики и контроля за действием ингибиторов адгезивно-агрегационной функции тромбоцитов используют коллагеновый материал, который в норме задерживает не менее 30% тромбоцитов, содержащихся в плазме. Такие свойства присущи коллагеновому материалу, приготовленному из раствора коллагена в сочетании с АДФ при соотношении коллаген-АДФ, равном (мас,%); (99,5-99,75)- (0,5-0,25).П р и м е р 1. Диагностика врожденного нарушения функциональной активности тромбоцитов (тромбоцитопатии). Описанным способом со стандартной тромбицитарной плазмой (200000 тромбоцитов в 1 мкл) определяют адгезивность тромбоцитов у 10 здоровых людей и больного с врожденным нарушением секреторной реакции тромбоцитов, установленным на основании тщательных исследований системы гемостаза, включающих определение адгезивности тромбоцитов обычным способом, а также агрегацию тромбоцитов при стимуляции АДФ, коллагеном, адреналином и ристомицином. У здоровых людей индекс адгезивности колебался в пределах 35-65% и составил в среднем 5014%, индекс адгеэивности у больного составил 8%. Получаемое различие в индекс адгезивности тромбоцитов позволяет диагностировать их функциональную неполноценность (тромбоцитопатия). П р и м е р 2. Оценка активности ингибитора функции тромбоцитов. Определяют адгезивность тромбоцитов в нормальной плазме, содержащей водорастворимый аспирин в концентрации 1 ммоль/л и в нормальной плазме, к которой был добавлен вместо аспирина адекватный объем физио- логического раствора МаС 1, При исследовании плазмы, содержащей антиагрегат, индекс адгезивности тромбоцитов равнялся 2, в контроле 47%, Различие в индексе адгезивности тромбоцитов дает объективную величину активности ингибитора.Предлагаемый способ пригоден для определения адге: ивности тромбоцитов в тромбоцитопенической плазме, Известно,что оценка адгезивно-агрегационной активности тромбоцитов при тромбоцитопении обычными методами невозможна. При необходимости исследователи прибегают к выделению тромбоцитов из большого обьема плазмы посредством центрифугирования или гельфильтрации и последующему их концентрированию посредством ресуспендирования в очень небольшом объеме специально приготовленного буферного раствора.Поскольку э 1 и методы являтюся очень трудоемкими и дорогостоящими, они практически не применяются в клинических условиях и доступны лишь некоторым исследователям,Предлагаемый способ дает возможность определять адгезивность тромбоцитов в условиях клиники, не прибегая к их выделению и концентрированию. Это достигается тем, что подсчет тромбоцитов в тромбоцитопенической плазме до и после пропускания через коллагеновую губку с повышенной тромбоцитзадерживающей способностью ведется не в обычном объеме плазмы, а в несколько большем объеме плазмы, Например, если обычно плазму для посчета тромбоцитов в тромбоцитарном счетчике разводя г в 3000 раз (3,3 мкл плазмы разводят в 10000 мкл изотона).то при1734020 35 40 45 50 Составитель А.П,АгуреевРедактор Ю, Середа Техред М.Моргентал Корректор М.Демчик Заказ 1667 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 тромбоцитопении разводят в 500-670 раз 1520 мкл плазмы разводят в 10000 мкл изотона,П р и м е р 3, Определение адгезивностиплазмы при тромбоцитопении, При подсчете количества тромбоцитов в крови и плазмебольного оказалось, что их было меньше30000 в 1 мкл. Поэтому определить адгезивность тромбоцитов известным методом пристоль небольшом количестве их практически невозможно, поскольку количество задерживающихся тромбоцитов находится впределах ошибки метода,Производят подсчет тромбоцитов вплазме, взяв не 3,3 мкл плазмы, как это 15делается обычно, а 20 мкл. При этом количество тромбоцитов в плазме оказалось равным 194000 в 1 мкл.Пропускают 200 мкл тромбоцитопенической плазмы больного через коллагеновую губку и снова подсчитывают количествотромбоцитов в 200 мкл. Аналогичным образом определяют индекс адгезивности тромбоцитов в 10 пробах нормальной плазмы,предварительно подсчитав количество тром боцитов в тромбоцитарной плазме и затемразведя ее быстромбоцитарной плазмой досодержания менее 30000 тромбоцитов в 1мкл, т.е, определяют индекс адгезивноститромбоцитов в 10 пробах нормальной плазмы с очень низким содержанием тромбоцитов. Сравнивают индекс адгезивности в норме (при искусственной тромбоцитопении в нормальной плазме), который колебался в пределах 11-30 и равнялся в среднем 20. Зф , и больного тромбоцитопенией, у которого индекс адгезивности составил 0 . Эти результаты позволяют диагностировать у больного тромбоцитопеническую тромбоцитопатию, т.е. наличие у больного не только дефицита, но и дефекта тромбоцитов.Таким образом, предлагаемый способ заметно повышает чувствительность метода, достаточного для дифференциации активных и неактивных тромбоцитов при их дефиците.Формула изобретения Способ определения адгезивности тромбоцитов путем фильтрации крови с последующим подсчетом количества тромбоцитов крови, задерживающихся на фильтре, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности, упрощения и ускорения способа, а также возможности определения адгезивности тромбоцитов в плазме, подсчитывают количество тромбоцитов в цитратной крови или плазме до и после фильтрации через материал, содер. жащий коллаген дермы и аденозиндифос фат при их соотношении (мас, ф ); (99,5-99,75) - (0,5-0,25), и рассчитывают в процентах количество тромбоцитов, задерживающихся в материале.