Способ определения активности киллеров

(я)5 6 01 й 33/53 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР р 02 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 2(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ КИЛЛЕРОВ(57) Изобретение относится к клинической.иммунологии. Цель изобретения - повышение точности способа, а также сокращениевремени анализа. Из крови обследуемыхвыделяют клетки-эффекторы в градиентеплотности, освобождаются от макрофаговпутем их прилипания к пластику. Затем Изобретение относится к клинической иммунологии и может быть использовано при диагностике нарушений активности естественных киллеров у обследуемых лиц,Цель изобретения - повышение точности способа и ускорение анализа.Способ осуществляют следующим образом.У обследуемого производят забор крови, выделение взвеси клеток-эффекторов в градиенте плотности, добавление к ним клеток К, инкубацию в среде, регистрацию гибели клеток Кв смеси и по величине гибели их определяют активность киллеров. Предварительно из взвеси клеток-эффекторов удаляют макрофаги, клетки Кдополнительно очищают в градиенте плотности, ЯО 1727078 А 1 клетки-эффекторы смешивают с клетками мишенями К, дополнительно очищенных в градиенте плотности. Смесь клеток помещают в питательную среду, содержащую 0,1 - 0,2% трипановой сини и 0,5 - 0.6% агара. Соотношение эффектор:мишень составляют равным 15 - 25:1, Клеточную взвесь в среде упомянутого состава помещают в плоский капилляр. Концы капилляра закрываюти инкубируютвтечение 4 - .5 ч при 37 С. По окончании инкубации под микроскопом просчитывают процент прокрашенных клеток-мишеней К. Этот процент отражает функциональную активность киллеров. По сравнению с прототипом увеличивается точность способа в 2-3,5 раза с сокращением времени анализа в 4 - 4,5 раза. центрифугированием и добавляют 80,000- 120.000 клеток мл до соотношения с клетками-эффекторами, равного 1;15 - 25, затем смесь клеток вносят в среду, содержащую 0,5 - 0,6% агара и 0,1 - 0,2% трипанового синего, заполняют капилляр, закрывают концы капилляра, инкубируют в течение 4 - 5 ч, а гибель регистрируют путем подсчета прокрашенных клеток.В предлагаемом способе в качестве эффекторов используют чистую лимфоцитарную взвесь.П р и м е р 1. Клетки-мишени К(Сэтаоце о 1 сеПпез НуЬГЫоааз), постоянно культивируемые и чтго известным образом в полной питательной среде, извлекают из нее. Перед работой суспензию К, взятую на 2 сут после пересева, наслаивают на ЕсоИ-Нура 9 ие (б = 1,077 г/см ) и центрифу згируют при 300 х 9 в течение 25 мин на центрифуге ОС- = 6 М, Подобная манипуляция необходима для удаления нежизнеспособн ых клеток (вследствие своей повышен ной плотности они оседают на дно).В данном случае до постановки цито- токсического теста определяют процент жизнеспособных К, который оказался не меньше 95 (с помощью известного метода по исключению 0,1%-ного раствора трипановой сини). После извлечения интер- фазы автоматической пипеткой в пробирку и 2-кратного отмывания клеток в питательной среде составляют клеточную суспензию (путем подсчета в камере Горячева) в концентрации 120000 кл/мл в полной питательной среде следующего состава:Сыворотка эмбрионов коров (СЭ К, коммерческая) 5 мл. Глютамин 0,04 гГентамицин 40 мкг/мл Среда ВРМДо 100 мл Далее проводят выделение клеток-эффекторов, Для этого кровь, взятую из вены обследуемого на гепарине в количестве 5 мл и разведенную в 2 раза средой 199, наслаивают на градиент ГсоИ-Нурацве (б = 1,077 г/см ) и центрифугируют при 300 в течение 30 мин при т = 20 С, Интерфазное кольцо собирают, дважды отмывают питательной средой и наносят на пластиковую поверхность, например, фирмы Роо (США), предварительно обработанную 20 О/-ной СЭК в полной питательной среде,По истечении 1 ч инкубации при т = 37 С суспензию неприлипших клеток (лимфоциты) сливают в отдел ьную пробирку, отм ы вают питательной средой, просчитывают количество лимфоцитов в камере Горячева и составляют концентрацию 1,8 10 кл/мл.В лунки круглодонных пластин для иммунологических реакций вносят по 0,1 мл клеточных суспензий лимфоцитов и клеток- мишеней Кв соотношении соответствен но, ра аням 15:1 (180000 клеток-эффекторов и 12000 клеток-мишеней),Пластины центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин, надосадок удаляют полностью и к клеточному осадку, оставшемуся в лунках пластин, добавляют 50 мкл предварительно приготовленной смеси, которую получали следующим образом.Брали навеску агара (00 со) в 30 мг. Добавляли к ней 1 мл полной питательной среды следующего состава:СЭ К (коммерческая) 15 млГлютамин 0,06 г 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Гентамицин 50 мкг Среда 199 До 100 мл выдерживали 30 мин и в водяной бане доводили смесь до состояния геля. Далее при Т геля 50 С добавляли 4,0 мл питательной среды вышеуказанного состава (0,6 Д агара), содержащей 0,005 г трипановой сини (0,1;,).Полученную смесь с клеточным осадком осторожно ресуспендируют при 37 С, Два 5-канальных плоских капилляра длиной 1 - 1,5 см и 0,25 мм опускают в приготовленную смесь (т + 37 С), содержащую клеточную взвесь,После заполнения капилляров смесью их концы закрывают пластилином или воском, капилляры помещают в чашки Петри и инкубируют при 37 С в течение 4 ч.Параллельно проводят инкубацию контрольных капилляров, В качестве контроля выступает чистая культура К, помещенная в те же условия. По окончании инкубации капилляры просматривают под световым микроскопом (8 х 20). Просчитывают число окрашенных (мертвых) клеток К по всей длине 10 каналов 2 капилляров и рассчитывают процент прокрашенных клеток. Среднее арифметическое результатов, полученных в 10 каналах, прямо пропорционально соответствует активности киллеров.Обсчет результатов проводили согласно стандартным методам вариационной статистики,Разброс результатов определения активности киллеров в прототипе в соотношении 25:1 составил 9 - 64/, т.е, более чем 7-кратный, а в предлагаемом способе - 14 - 26/т.е. менее чем 2-кратный. Точность, таким образом, в предлагаемом способе при соотношении 25:1 выше в 3,5 раза.При соотношении 15;1 разброс в прототипе составил от 5 до 240 , т.е. более чем 4-кратный, а в предлагаемом способе разброс оставил 8 - 17/, т.е, почти 2-кратный. Точность, таким образом, в предлагаемом способе при соотношении эффектор:мишень 15:1 выше в 2 раза.Таким образом, в предлагаемом способе результат цитотоксического действия ЕК фиксируется визуально, т.е, определяется глазом прямой эффект цитотоксического действия. В прототипе и аналоге этот эффект отражается косвенно либо по выходу "Сг, либо по выходу фермента из клеток- мишеней. Поэтому несмотря на обьективный учет интенсивности -излучения на счетчике радиоактивности или степени ферментативной реакции на спектрофотометре, результат предлагаемого капиллярного.Формула изобретения Способ определения активности киллеров, включающий забор крови, выделениеклеток-эффекторов в градиенте плотности,25 30 35 40 50 Составитель В.Литовченко Редактор М.Келемеш Техред М.Моргентал Корректор М,МасимишинецЗаказ 1277 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва,Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 теста будет ближе к ситуации в организме (1 и ччо), что повышает его точность в диагностическом плане,Предлагаемый способ занимает значительно меньше времени (в 4 - 4,5 раза) по сравнению с прототипом, На проведение известного метода требуется 48 ч, а на предлагаемый 10 - 12 ч. Это обстоятельство позволяет использовать способ при массовом обследовании населения, при этом за 1 рабочий день можно оценить МК-активность предлагаемым способом у 10 - 15 человек, а по прототипу получить результаты можно только через 2 сут. инкубацию их в присутствии клеток Кс последующей регистрацией гибели клеток К, по количеству погибших клеток определяют активность киллеров, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, целью повышения точностиспособа и сокращения времени анализа, после выделения клеток эффекторов отделяют от них путем инкубирования на пластике макрофаги, клетки Кперед инкубацией 10 с клетками-эффекторами дополнительноочищает центрифугированием в градиенте плотности, добавляют их в количестве 80000 - 120000 клеток/мл к клеткам-эффекторам до соотношения 1:15-25, инкубируют 15 в среде, содержащей 0,5-0,62 агара и 0,1 -0,2 О трипанового синего в капилляре с закрытыми концами в течение 4-5 ч, а гибель клеток регистрируют подсчетом окрашенных клеток.20