Способ определения функционально-активных лейкоцитов

(51)5 6 01 Й 33/4 тут КЦИОескои Вано с итета вляетГОСУДАРСТВЕ ННЫИ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР ИСАНИЕ ИЗОБ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(71) Волгоградский медицинский инс(57) Изобретение относится к клинииммунологии и может быть использоцелью диагностики нарушений иммув стоматологии. Целью изобретения обретение относится к области медиины, а именно к иммунологии.Целью изобретения является повышеие чувствительности,Способ осуществляют следующим образом,У больного делают ополаскивающий смыв 5 мл физраствора в течение 20-30 с и его сбрасывают. Через 2-3 мин повторяют процедуру смыва с полости рта и всю смывную жидкость собирают в градуированную центрифужную пробирку, Жидкость изо рта сливают медленно, так, чтобы не образовалась пена. Слюну не собирают в пробирку. В полученный смыв (примерно 4-5 мл) добавляют 0,5 мл 10-кратной среды 199 и оставляют в холодильнике до полного оседания клеточной фракции. Надосадочную жидкость сливают, а клетки (лейкоциты) в осадке исследуют хемиалюминисцентным методом. Л юминол 10-3 М готовят следующим образом; навеску 10 мг сухого люминола фирмы "Серва" суспендируют в 1 мл физраствора и подогревают до 45-50 С, Нерастворившийся люминал отдеся повышение чувствительности способа, Способ осуществляется посредством определения окислительно-восстановительных свойств нейтрофилов хемилюминесцентным методом в смывах с полости рта, которые смешивают со средой 199 в соотношении 101 и выдерживают при +4 С до полного осаждения клеточной фракции, добавляют люминол в конечной концентрации 10 э М и пирогенал (25 МПД/мл). Таким образом повышают чувствительность способа, что позволяет определять функциональную активность нейтрофилов в концентрации 10 клеток/мл. 1 табл. ляют фильтрованием через миллипоровые фильтры с диаметром пор 0,2 мкм. Профильтрованный раствор хранят в холодильнике и используют в неразведенном виде. При измерении хемилюминесценции лейкоцитов в присутствии люминола записывают показания в гич сдисплея прибора наибольшую цифру иэ трех, возникающих каждые 1-2 сек, Функци- О ональную активность лейкоцитов полости СО рта изучают в присутствии стимулятора пи- О, рогенала. Для этого в 3 кюветы (стимулированный тест) вносят по 50 мкл из осадка лейкоцитов и по 25 мкл раствора пирогенала (коммерческий раствор 25 МПД/мл) и в 3 другие кюветы добавляют по 25 мкл физраствора (контроль). Кюветы встряхивают, добавляют по 10 мкл люминола и оставляют на а 45 мин при 37 С, Через каждые 15 мин кюветы вынимают из термостата и измеряют хемилюминесценцию на приборе ЛКБ(Финляндия). Интенсивность хемилюминесценции определяют как светосумму в вч трех измерений. Коэффициент активации лейкоцитов(К) полости рта в присутствии пирогенала рассчитывают по следующей формуле:а - ЬК= -агде а - светосумма хемилюминисценции нейрофилов в присутствии пирогенала;Ь - то же самое без такового.Пример осуществления способа.Исследование функциональной активности лейкоцитов полости рта у больного Е-ва, 46 лет с диагнозом верхушечного периодонтита.У.больного делают ополаскивающий смыв 5 мл физраствора в течение 20-30 с и его сбрасывают, Через 2-3 мин повторяют процедуру смыва с полости рта и всю смывную жидкость собирают в градуированную центрифужную пробирку, Жидкость иэо рта сливают медленно, так, чтобы не образовывалась пена, Слюну не собирают в пробирку, В полученный смыв 5 мл добавляют 0,5 мл 10-кратной среды 199 и оставляют в холодильнике до полного соединения клеточной фракции. Надосадочную жидкость сливают, а кпетки (лейкоциты) в осадке исследуют хемилюминесцентным методом. Люминол 10 М готовят следуюэщим образом: навеску 10 мг сухого люминола фирмы "Серва" суспендируют в 1 мло физраствора и подогревают до 45 - 50 С. Не- растворившийся люми нол отделя ют фильтрованием через миллипоровые фильтры с диаметром пор 0,2 мкм Профильтрованный раствор хранят в холодильнике и используют в неразведенном виде, При измерении хемилюминесценции (ХЛ) лейкоцитов в присутствии люминола записывают показатели в гпч с дисплея прибора наибольшую цифру иэ трех, возникающих каждые 1-2 с. Функциональную активность лейкоцитов полости рта изучают в присутствии стимулятора пирогенала, Для этого в 3 кюветы (стимулированный тест) вносят по 50 мкл из осадка лейкоцитов и по 25 мкл раствора пирогенала (коммерческий раствор 25 МПД/мл) и в 3 другие кюветы добавляют по 25 мкл физраствора (контроль). Кюветы встряхивают, добавляют по 10 мкл люминала и оставляют на 45 мин при 37 С, Через каждые 15 мин кюветы вынимают из термостата и измеряют ХЛ на приборе ЛКВ 1250 (финляндия), Интенсивность ХЛ определяют как светосумму в глч трех измерений,Коэффициент активации лейкоцитов (К) полости рта в присутствии пирогенала рассчиты 5 вают по следующей формуле;К =(а-Ь):а, где а -светосумма ХЛ нейтрофилов в присутствиипирогенала; Ь - то же самое, беэ такового. Внорме коэффициент активации составляет0,20 - 0,30. При наличии заболевания способ 10 ность нейтрофилов к стимуляции низкая (К0,2). Количество лейкоцитов в пробе составило 10 /мл. Результаты отражены в таблице,Из таблицы видно, что предлагаемыйспособ позволяет выявить восстановление15 функциональной активности лейкоцитов полости рта после лечения (до лечения эта активность была снижена, К равен 0,06 и 0,24соответственно), По известному способу неудалось выявить какие-либо функциональные20 изменения в лейкоцитах как до, так и послелечения, Объясняется это тем, что в пробенаходилось количество лейкоцитов менее10 /мл,Таким образом, повышение чувствитель 25 ности способа делает возможным определение окислительно-восстановительных5свойств лейкоцитов в концентрации 10 /мл,В известном способе для такого определения необходима концентрация клетокне30 менее 10 /мл. Формула изобретения Способ определения функционально-активных лейкоцитов путем выявления окисли тельно-восстановигельной способности иххемилюминесцентнйм методом, о т л и ч а ющ и й с я тем,что, с целью повышения чувствительности, интенсивность хемилюминесценции лейкоцитов измеряют в смыве с 40 полости рта, который смешивают с 10-кратной средой 199, выдерживают при 4 С до полного осаждения клеточной фракции, добавляют к ней люминал в концентрации 10М, в опытную пробу до введения люминола 45 дополнительно вводят пирогенал в конечнойконцентрации 25 МПД/мл и по разнице хемилюминесценции до и после введения пироге- нала определяют показатель функционально активных лейкоцитов.1686355 Составитель Г. Буц иваТехред М.Моргентал Корректор М. Демчик Редактор Л. Лашкова Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 Заказ 3594 Тираж Подписное . 8 НИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5