Способ определения концентрации этанола в биологическом материале и выдыхаемом воздухе

/9 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ кутского филиала. Кершенгольц,асов и Х. Х. Турни еское руководство сшая школа, 1980 ЛЕНИЯ КОНЦЕНТБИОЛОГИЧЕСКОМ АЕМОМ ВОЗДУХЕ концентрации этаатериале и выдыхасится к области метрирование Изобретени именно к спос экспертизы, ди ности к алкогол зовано нарколоЦель изобр вительности и нола в биоло выдыхаемом во носится к медицине, а судебно-медицинской тики предрасположен- и может быть исполькой службой,ия - повышение чувст- ости определения этаском материале и е от бам агносизму гичес етен точн гиче здухе Способ осуществляюзом.Биологический матерно подвергают микропесодержащий 0,1 М, рН 10фер, водный раствор НАДнитротетразолий фиоперегнанную пробугидрогеназы (активноляет около 24 МЕ) следующим обраал предварительегонке, В раствор, глицин/йаОН-бу(24 мг/мл) и иодетовый, вносят твор алкогольдефермента составемян пшеницы с и растьиз с ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 21) 4658456/14(71) Институт биологииСО АН СССР(54) СПОСОБ ОПРЕДЕРАЦИИ ЭТАНОЛА ВМАТЕРИАЛЕ И ВЫДЫХ(57) Способ определениянала в биологическом мемом воздухе атно медицины, в частности к судебно-медицинской экспертизе для определения степени опьянения и диагностики предрасположенности к алкоголизму. С целью повышения чувствительности и точности способа при работе с биологическим материалом его предварительно подвергают микроперегонке, пробу вносят в раствор, содержащий НАД, алкогольдегидрогенаэу из семян пшеницы, иоднитротетразолий фиолетовый с последующим спектрофотометрированием. При определении этанола в выдыхаемом воздухе последний барботируют через указанный раствор, Использование изобретения позволяет повысить чувствительность определения этанола до 10 - 12 раз, 2 з. и. ф-лы, 2 табл. последующим фото м при длине волны 510 нМ,При определении этанола в выдыхаемом воздухе последний барботируют через раствор, содержащий 0,1 М глицин/)чаОН- буфер, рН 10, алкогольдегидрогеназу из семян пшеницы, НАД, Затем вводят иоднитротетразолий фиолетовый. Реакцию останавливают через 10 мин 0,2 М соляной кислотой и производят фотометрирование при той же длине волны.П р и м е р 1. Определение этанола в сы зоротке крови.Предварительно путем микроперегонки отделяют этанол от сыворотки. Для этого 3 мл сыворотки помещают в пенициллиновый флакон, Туда же помещают стеклянные или пластмассовые открытые капсулы, объемом 0,8 - 1 мл, так чтобы верхний слой капсулы был ча 4 - 5 мл выше уровня сыворотки во(2),е плотности ьной пробах барботируемого через р выдыхаемого воэдуиндикха; 6,57 - коэффиц нола на 1 л выдыха При наличии эт духе раствор окраш окраска которого кислотой может со недель при сохране Данные привед Предложенный сить чувствительно до 10-12 раз.иент пересчета 1 мкемого воздуха.анола в выдыхаемоивается в красныйпри фиксации сохраняться в течени нии в темноте приены в табл. 1-2.способ позволяетсть определения эт возцвет ляной е 4-6 +4 С овы- нола бретения ения концентрации м материале и выдыэаимодействия проодержащим НАД, с последующим фоичающийсятем, ия чувствительности лкогольдегидрогенав раствор дополни- нитротетраэолийА/В, (1)(ЭТА Н ОЛ) сы вор отки= оэфф ент эведения отго танола, определенграфику;концентрированиясыворотки равныйой сыворотке к объфлаконе. В капсулы опускают наконечникиохлаждающей системы, Нагревают флаконы на водяной бане при 80 С в течение 1 ч,Пары летучих жидкостей, включая этанол,конденсируются на охлаждающих наконечниках микроперегонки и стекают в капсулу,объем конденсата в капсуле достигает 0,30,5 мл. При этом достигается отделение этанола от белков и многих других веществсыворотки крови, а также его концентрирование. Измеряют точный объем собранногоконденсата в капсуле. Подготовленная проба может храниться в закрытой капсуле несколько дней,Строят калибровочную кривую, Дляэтого определяет зависимость начальнойактивности приготовленного перед измерением раствора алкогольдегидрогеназы отконцентрации стандартных растворов этанола,Раствор алкогольдегидрогеназы передупотреблением готовят растворением лиофилизированного препарата из расчета 20мг на 1 мл бидистиллированной воды (активность фермента составляет около 24 МЕ).Активность фермента определяют следующим образом.В спектрофотометрическую кювету вносят 1,1 мл М, рН 10, глицин/йаОН-буферного раствора, 0,1 мл 36 мМ водного раствораНАД (24 мг/мл), 0,1 мл иоднитротетразолиевого фиолетового с исходной концентра цией 3,8 мг/мл и 0,2 мл раствора этанола сизвестной концентрацией от 0,75 до 75 мМ,Реакцию инициируют введением 0,2 мл раствора алкогольдегидрогеназы. Измерениеоптической плотности фиксируют при длиневолны 510 нм на спектрофотометре или фотоэлектрокалориметре.Для определения содержания этанола всыворотке крови определяют активность алкогольгидрогеназы аналогично описанному, но вместо раствора этанола с известнойконцентрацией вводят в кювету 0,2 мл от она из капсулы. По калибровочной кривой находят концентрацию этанола в кювете.Затем рассчитывают концентрацию этанола в сыворотке крови по формуле где А - к ици кювете;С - концентрация ная по калибровочномВ - коэффициент при отгоне этанола и отношению объема взя ему отгона в капсуле. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 П р и м е р 2. Определение этанола в выдыхаемом воздухе.Для определения этанола в выдыхаемом воздухе последний медленно барботируют через раствор, содержащий 2 мл 0,1 М глицин/йаОН-буфер рН 10, в котором растворены 1 мг алкогольдегидрогенаэы и 2 мг НАД. Объем барботируемого воздуха равен 1 литру (можно брать 2 или 3 л). Затем вводят 0,05 мл 5,4 мг/мл иоднитротетразолиевого фиолетового. Реакцию останавливают через 10 мин 0,2 М соляной кислотой. Контролем служит пробирка, содержащая аналогичные реагенты, через которую воздух не барботировали.Расчет концентрации этанола проводили по формуле Где Оопыт и Оконтр оптич раствора в опытной и кон при 510 нм;Ч - общий объематорный раство Формула изо 1. Способ определ этанола в биологическо хаемом воздухе путем бы с раствором, с алкогольдегидрогенаэу тометрированием, о т л что, с целью повышен способа, используют а зу из семян пшеницы, тельно вносят иод фиолетовый. 2. Способ по и. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности и точности при работе с биологическим материалом, пробу предварительно подвер гают микроперегонке.1666956 Таблица 1 Определение концентрации зтанола в выдыхаемом воздухе б л Определение концентрации этанола в цельной кропи с и гомогенатак тканей предлокенным способом и спо оротке крови бом-прототип кроль(л мкмоль(л ткани Концентрация этанол ето еделени ьная кровь я и+нчен Гомогенат печсуслика воротка ви и э и+н огольде гидр еэа печениади (прото 4 7 В 6+ 65,3,6 542+ 25 42 750+ 1 4 Ч,5 17 Р 0,0 РсО О Алко гольде гид ров генаэпше 1 2 66+ 14 В, 9 54,4+ г 5 В,3 Вг+7,4 В 20,4 24 23 21 сО Составитель Н.ТеренинаТехред М.Моргентал Коррект дактор Л,Пчолинск ирня аказ 2519 Тираж 415 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКН 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 агарина, 10 оизводственно-издательский комбинат "Патент", г. Уж 3. Способ по и, 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа при работе с выдыхаемым воз Гомогена человека Т 1 1 г духом, пробу барботируют через полученный раствор,Г 1: 1:.5 46 53432