Способ раздельного получения бесклеточных экстрактов листьев папортника и цианобактерий из симбиотической системы azolla-аnаваеnа azolla

Целью изобретения является улуч - жение качества разделения и повы - шение выхода растворимых белков папоротника и цианобактерий,Основу предлагаемого способа составляет новая совокупность методических приемов, относящихся преимущественно к режимам гомогенизации и фракционирования растительного материала и направленных на устранение условий, которые приводят к взаимноу загрязнению двух типов получаемых белков, и обеспечение наиболее полной экстракции растворимых веществ бел,ковой природы,Способ предусматривает 6 основных стадий: гомогенизацию листьев в .,фарфоровой ступке, фильтрование гомогената низкосортное центрифугироФ вание фильтрата, промывание клеток цианобактерий (осадок) центрифугированием, растирание кпеток цианобак - терий с песком в Фарфоровой ступке, а также высокоскоростное центрифугирование гомогената цианобактерий и супернатанта после первого центрифугирования фильтрата листьев папоротника.При точном соблюдении предлагаемых режимов гомогенизации и разделения новый метод обеспечивает получение из 5 г исходного материала 70 мг растворимого белка азоллы и 7 мг растворимогб белка анабены, отличающихся высоким уровнем нативности и чистоты разделения, которые контролируют электрофоретически и по активности рибулозодифосфаткарбоксилазы. Время анализа примерно 2 ч П р и м е р 1. Выращивание трехвидов азоллы (А, р 1 ппаса, А,Г 1111 сц 1 оЫез, А.саго 1 1 п 1 апа) проводятв оранжерее под люминесцентными лампами при 25000 люкс в плоских кюветах (эмалированных), заполненныхпитательной средой Таллея, не содержащей связанного азота, Питательнуюсреду меняют через три дня. Для опытов используют 7-дневные культурыазоллы, которые содержат в основномвегетативные клетки цианобактерий,Состав среды, мМ: СаС 1 0,8; КН".ОФ,0,2; КБО 0,5; МБО 0,5; ИаС 1 0,1;НЗВО 1; СоС 1 1; СцБО, О, 1; железов виде этилендиаминтетраацетатногокомплекса 50, ИаМо 80 0,2 мкМ;ЕпБО 0,2 мкМ,Получение гомогената листьев папоротника А, р 1 ппаСа, 5 г азоллы безкорней (корни удаляют ножницами) рас 5тирают при 0-4 фС в фарфоровой ступкев течение 15 мин в присутствии 1 О мпраствора А: 0,05 Мтрис-НС 1 буфер,рН 8,5, содержащий 0,2 М хлористыйнатрий, 0,0005 М этилендиаминтетраацетат (ЭДТА)ф, 0,01 М дитиотреитол,0,01 М хлористый магний, 2 Е-ный поливинилпирролидон. Получецный гомогенат Фильтруют через 8 слоев марлис ватой. Фильтрат центрифугируют2 мин при 1000 д.Получение бесклеточного экстракталистьев папоротника, Надосадочнуюжидкость, полученную после центрифугирования Фильтрата, подвергают высокоскоростному центрифугированию(30 мин при 23000 е), Полученныйнадосадочный раствор (бесклеточныйэкстракт) содержит растворимые белкилистьев папоротника (л 70 мг), Для 25 доказательства нативности белка используют тест на активность рибулозодифосфаткарбоксилазы (КФ 4.1.1.39)- фермента, который составляет около 503 от растворимых белков листьеврастений. Исследованная в бесклеточном экстракте удельная активностьэтого фермента 0,23 ед/мг белка исравнима с известной для других растений.35Получение клеток цианобактерий.Осадок, полученный после центрифугирования фильтрата при 1000 я в течение 2 мин, четыре раза промываютраствором А путем центифугированияпри 1000 8 в течение 2 мин. Промытый осадок представляет собой клетки цианобактерии ( 50 мг). Осадоксуспендируют в 5 мл раствора А,Получение бесклеточного экстракта цианобактерии. Суспензию цианобактерий растирают в фарфоровой ступке в течение 15 мин в присутствиимелкого, бесцветного кварцевого песка с размером песчинок 0,2-0,5 мм.50Гомогенат центрифугируют 30 мин при23000 я, Надосадочный раствор (бесклеточный экстракт), содержащий 7 мграстворимых белков, имеет характерный для цианобактерий .сине-зеленыйцвет, Для доказательства нативности .55белка используют тест на активностьрибулозодифосфаткарбоксила зы, Величина удельной активности рибулозоди.фосфаткарбоксилазы, определенная в1615174 Формула изобретения Составитель О,СкуратовскаяРедактор Н,Гунько Техред Л.Сердюкова Корректор М,Самборская Заказ 396 1 Тираж 491 Подписное,ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 бесклеточном экстракте симбиотической цианобактерии, 0,35 ед/мг белка и оказалась одного порядка с величиной удельной активности этогофермента из клеток свободноживущихцианобактерий,П р им е р 2. Способ осуществляютаналогично примеру 1,однако растираниелистьев папоротника в фарфоровойступке. ведут менее 12 мин (10 мин),что приводит к снижению выхода растворимых белков листьев папоротникадо 50 м, а также к снижению содержания растворимых белков цианобактерий до 5,0 мг,П р и м е р 3. Способ осуществляют аналогично примеру 1, однакорастирание листьев в фарфоровой ступке ведут более 15 мин (20 мин), чтоне приводит к дальнейшему повьппениювыхода растворимых белков листьевпапоротника и клеток цианобактерий,При растирании клеток цианобактерийс песком более 15 мин повышения выхода растворимых белков также ненаблюдается, поэтому повьппение времени растирания нецелесообразно,П р и м е р 4, Способ осуществляют аналогично примеру 1, но присоотношении листьев папоротника ибуферного раствора (вес/объем) 1:5,Результаты аналогичны полученнымв примере 1.П р и м е р 5. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но привесовом соотношении клеток цианобактерий и буферного раствора (вес//объем) О,1;8. Результаты аналогичныполученным в примере 1,П р и м е р б. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но используют листья папоротника Аго 11 асаго 11 п 1 апа. Результаты аналогичныполученным в примере 1,П р и м е р 7. Способ осуществляют согласно примеру 1, но используют листья папоротника Аго 11 а 111 дсц 1 оЫез, Результаты аналогичны полученным в примере 1,6Та ким образ ом, при точном с облюдении разработанных режимов предлагаемый способ позволяет обеспечитькачественное разделение растворимых 5чбелков папоротника и цианобактериииэ симбиогической системы Аго 11 аАпаЬаепа аго 11 а, а также повыситьвыход целевого продукта как за счетполнты разделения тканей папоротника и цианобактерий, так и благодарясозданию условий для максимальныхуровней экстракции белковых веществ,15Использование изобретения способствует развитию научных и приклацных работ, направленных на внедрение новой весьма перспективной сельскохозяйственной культуры,Споссб раздельного получения бесклеточных экстрактов листьев папоротника и цианобактерий из симбиотической системы Аго 11 а-АпаЪаепа аго 11 а, включающий гомогениэацию растиранием в фарфоровой ступке растительного материала в буферном растворе, фильтрование гомогената, отделение клеток цианобактерий при помощи низкоскоростного центрифугирования с контролем результата осаждения, разрушение клеток цианобактерий с последующим центрифугированием гомогената, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью улучшения качества разделения и повьппения выхода растворимых белков, гомогенизацию листьев и цианобактерий ведут в течение 12-15 мин, разрушение осажденных клеток цианобактерий осуществляют путем растирания в ступке с кварцевым песком вбуферном растворе при соотношении масса/ /объем 0,1:8-10, а гомогенат цианобактерий и полученный после низкосортного центрифугирования супернатант подвергают для удаления нераст" воримой ФРакции центрифугированию,