Способ определения изоэлектрической точки белка

(51)5 С 01 И ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАН АВТОРСКОМ НИ(72) (53) (56) во И 7.меров 492 СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИЗОЭЛЕКТЙ ТОЧКИ БЕЛЦАИзобретение относится к молй биофизике и предназначеноения характеристик белков-и 57) ярн зме кудляотеи т Изобр лярной бекуно для -проится ение отфизике азна змерен еинов,характеристик белко именно их изоэлектр ес точек,Целью изобретения. является повьппение чувствительности и точности определения изоэлектрической точки белков,Сущность способа заключается вследующем.,Облучают среду, содержащую макромолекулы поляризованным оптическимизлучением, регистрируют поляризованную (11) и деполяризованную (1 )компоненты рассеянного света при различных рН среды и различных концентрациях раствора белка (С), затемопределяют зависимость коэффициентадеполяризации (д,1), экстраполяризованного к нулевой концентрации белка,о ртщей 4457131/301,06.8815.07.90,МГУ им, М.Г.П,Петров535.511.(0Нейрат Г.,остраннаянфорд Ч, фМ.: Изд-во Е ИЗОБРЕСВИДЕТЕЛЬСТВ нов, Цель изобретения - повышениечувствительности и точности определения изоэлектрической точки бепротеиновДля этого облучают,содержащую макромолекулы, полванным оптическим излучением,рируют поляризованную и деполванную компоненты рассеянногопри различных рН среды и различныхконцентрациях раствора белка затемопределяют зависимость коэффициентадеполяризации, экстраполированногок нулевой концентрации белка, от рНраствора, по положению экстремумаэтой зависимости находят значениярН, соответствующие изоэлектрическойочке белка. 1 ил,от рН раствора и по положению экстремума этой зависимости находят значения рН, соответствующие изоэлектрической точке белка,На чертеже представлены графики зависимости коэффициентов деполяризации от рН раствора для водных растворов Х-глобулийа и сывороточного альбумина (НБА). Из приведенных экспериментальных зависимостей видно, что для альбумина (1) экстремум зависимости коэффициента деполяризации от рН соответствует рН=4,7, а для Х-глобулина (2) - рН 6,1.Способ осуществляют следующим бразом.Приготавливают серию образцов растворов исследуемых белков в станда ных стеклянных кюветах с уменьшаю ся концентрацией (исходные значенияконцентраций не более нескольких Е)и различными значениями рН раствора.На установке, предназначенной дляизмерения интенсивности поляризованного и деполяризованного излучения,с лазерным источником света, фотоэлектрической регистрацией и поляризационным устройством (призмы Волластона и Глана-Томсона) производят измерения поляризованной и деполяризованной компонент света, рассеянногоот образцов белковых растворов подуглом регистрации -900. Строят графикзависимости отношения интенсивностейдеполяризованной (1) и поляризованной (1) компонент от концентрациибелка (С) и рН раствора, Положениеэкстремума этой, зависимости (д ==й(рН) при С -ф О определяет значениерН, соответствующее иэоэлектрическойточке белка,ФПадающая на рассеивающую средумонохроматическая световая волна Е==Е е индуцирует в молекуле переменный дипольный момент р=Е, где с -поляризуемость молекулы, Для совершенно изотропных молекул О является скаляром, и основной вклад в интенсивность рассеянного излучения в раство- ЗОрах макромолекул дает рассеяние нафлуктуациях концентрации,В общем случае, когда рассеивающийобъем обладает оптической анизотропией, поляризуемость определяет соотношение величин.и ориентаций в пространстве двух векторов - найряженности электрического поля Е и индуциро"ванного дипольного момента р, и опи. сывается тензором второго ранга, называемым тензором поляризуемости,Если падающий и рассеянный лучилежат в горизонтальной плоскости иосоставляют угол 90 , причем падающийлуч поляризован в вертикальной плоскости, флуктуации ориентаций оптическойанизотропии молекул приведут к появлению в рассеянном излучении горизонтальной поляризованной составляющей,Отношение интенсивности деполяризо"ванной и поляризованной составляющихрассеянного излучения называется коэффициентом деполяризации, й =1/1,где 1и 1- горизонтально и вертикально поляризованные компоненты рассеянного излучения, Зарядовые свой ства поверхности макромолекул белков определяют их электронную поляризуемость, которая является основным физическим,параметром в явлении рэлеевского рассеяния. При перезарядке молекул с изменением рН среды резковозрастает интенсивность рассеянного света, связанного с флуктуациями концентрации растворов, При этом должныизменяться и поляризованные характеристики среды, связанные с флуктуациями ориентации аниэотропных молекул.Различный знак производной приведенных на чертеже зависимостей для альбумина и у-глобулина может быть объяснен различием в распределении электронной плотности у поверхностных групп белковых макромолекул.Таким образом, предлагаемый способ отличается от прототипа пбвьппенной чувствительностью, а также более высохой точностью определения изоэлектрической точки белка.При осуществлении данного способамогут быть использованы стандартныеустановки, применяющиеся для измерения интенсивности рассеянного света,требуется очень малое количество исходного вещества, не требуется использования охлаждающей системы, падающее на среду излучение не вноситвозмущения и не изменяет параметровбелка,Формула и з обретенияСпособ определения изоэлектрической точки белка, основанный на измерении рН среды,. содержащей белковые макромолекулы, о т л и ч а ю. щ и й с я тем, что, с целью повьппения чувствительности и точности определения, облучают среду, содержащую белковые макромолекулы, поляризованным оптическим излучением, регистрируют поляризованную и деполяризованную компонен" ты рассеянного света при различных рН среды и различных концентрациях раствора белка, затем .определяют зависимость коэффициента деполяризации, экстраполяризованного к нулевой концентрации белка, от. рН раствора,и по положению экстремума этой зависимости находят значение рН, соответствующеееизоэлектрической точке белка.1578597 М С006 005 Составитель А.Грузинцеведактор А,Лежнина Техред М.Ходанич . атай оррект Тираж 512 Подписноетвенного комитета по изобретениям и о 113035, Москва, Ж, Раушская наб.,12 НИИПИ Госу КНТ ССС ткрытия и д. 4/5