Способ выращивания клеток печени

25 Суспензию гепацитов наносят на матрицу с помощью пипетки каплями из расчета 100 мкл на 10 мг сорбента, выдерживают 15-20 мин при 37 С воСО-инкубаторе, после чего в сосуды для культивирования добавляют избы 55 ток среды и продолжают инкубацию в подходящих условиях. Среду меняют обычным способом ежедневно. Об эффективности прикрепления гепатоцитов суемных волокнистых материалов позволяет повысить полезную площадь культивирования без увеличения общего объема аппаратуры, а также улучшить5 кооперативное взаимодействие культивируемых клеток печени. При этом особое значение имеет покрытие волокнистых материалов коллагеном или полилизином, улучшающим адгеэию гепатоцитов, а также емкость углеродного сорбента и толщина структурированной матрицы.Способ иллюстрируется следующими примерами, 5П р и м е р 1. Клетки печени выделяют в стерильных условиях иэ ткани печени крысы последовательно,проточной перфузией раствором: 0,027 М цитрат натрия, 0,9 -ный хлористый нат рий, 0,05%-ная глюкоза, 5 мг/л гепарин (рН 7,35), затем рециркуляцией 0,05%-ной коллагеназы на растворе Хенкса. Из суспензии изолированных клеток печени гепатоциты осаждают центрифугированием 50 я 3 мин, суспендируют в среде для культивирования в концентрации 10 млн/мл. Среда для культивирования имеет следующий состав: среда Игла 10 -ный гидролизат лактальбумина, 20 -ная сыворотка крупного рогатого скота, антибиотики (по 100 мкг/мл среды пе" нициллина и стрептомицина).Матрицу готовят следующим образом.Углеродный сорбент с объемом сорбционных пор по бензолу 0,5 см/г, структурированный в виде войлока, толщиной 3 им стерилизуют кипячением в дистиллированной воде, пропи тывают 0,02 -ным раствором коллагена, высушивают в стерильных условиях в вакуумном сушильном шкафу прио37 С. Перед нанесением клеток матрицы переносят в сосуды для культивирования (чашки Петри), увлажняют средой для культивирования, избыток которой удаляют с помощью фильтровальной бумаги. дят по количеству открепившихсяклеток, выявляемых в среде на 2-3-тьисутки после нанесения.Количество неприкрепившихся клеток в % от числа нанесенных составляет соответственно на 2-е и 3-и сутки культивирования 10,5 и 0,9%. Вданном варианте на 1 мг матрицы куль -тивируют 6,5-7,5 х 10 гепатоцитов,ФМикроскопирование разъединенных наотдельные волокна матриц показывает,что гепатоциты растут хорошо, частьиз них прикреплена непосредственно кволокнам, а основная масса клетокрастет в виде агрегатов различныхразмеров в межволоконном пространстве.П р и м е р 2. Условия проведения эксперимента такие же, как и впримере 1, но матрицу готовят следующим образом: стерилизованный кипячением войлочный сорбент с объемомсорбционных пор по бензолу 0,5 см /г,толщиной 3 мм пропитывают 0,02 -нымраствором полилизина и высушиваютстерильно в вакуумном сушильном шкафу при 37 С. Количество клеток, неприкрепившихся при нанесении и выявленных в среде для культивированияна 2-е и 3-и сут, составляет соответственно 8,5 и 1% от числа нанесенных,В данном варианте на 1 мг матрицы, покрытой полилизином, культивируют 7-8 х 10 гепатоцитов,фП .р и м е р 3. Условия проведения эксперимента соответствуют примеру 1, а в качестве матрицы используют углеродный сорбент с объемомсорбционных пор по бензолу 0,5 смз /г,структурированный в виде войлока толщиной 3 мм, но без предварительногопокрытия Коллагеном или полилизином.При этом количество клеток, выявленных в среде для культивирования на 2-е и 3-и сут после нанесения, составляют соответственно 32и 35% от числа нанесенных. Следовательно, данный вариант матрицы, не покрытой коллагеном илиполилизином, непригоден для культивирования гепатоцитов,П р и м е р 4. Условия проведения эксперимента соответствуют примеру 1 за исключением толщины матрицы, составляющей 5 мм и объемом сорбционных пор по бензолу 0,5 см /г. Количество гепатоцитов, не прикрепившихся при92 бпатоцитов составляет 23,5, в последующем также отмечается открепление значительного числа клеток,ство клеток печени, культивируемыхпо предлагаемому способу, в 6- 10 развыше, чем в известных способах,основанных на выращивании клеток наплоских или сферической формы подложках. Культивируемые на матрицахгепатоциты могут быть трансплантированы в брюшную полость сингеннымживотным с экспериментальной желтухой, что позволяет также оценитьжизнеспособность и функциональнуюактивность высокодифференцированных клеток печени, растущих на матрицах, по коррекции печеночной недостаточности у животных-рецепиентов,Формула изобретения Способ выращивания клеток печени путем глубинного культивирования в питательной среде, о т л и ч а ю - щ и й с я тем., что, с целью повышения эффективности прикрепления, роста и функционирования клеток, культивирование ведут на матрицах толщиной в 3-10 мм, выполненных иэ нетканого распущенного углеродного сорбента с объемом сорбционных пор по бензолу 0,5-0,8 см/г, предварительно покрытого коллагеном или полилизином. Составитель А.МаныкинРедактор М.Недолуженко Техред М.Ходанич Корректор М.Самборская Заказ 1891 Тираж, 490 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 515781 нанесении и выявленных в среде для культивирования,составляет соответственно 8 и ЗХ от числа нанесенных. В данном варианте на 1 мг матрицы, представляющей собой структурированный в виде войлока толщиной 5 ммуглеродный сорбент, культивируют 7,5- 8,5 х 10 гепатоцитов.П р и м е р 5. Условия проведения эксперимента соответствуют примеру 1 за исключением толщины матрицы, составляющей 8-10 мм, из углеродного сорбента с объемом сорбционных пор по бензолу 0,5 см /г. При этом . количество гепатоцитов, не прикрепив- шихся при нанесении и выявленных в среде для культивирования на 2-е и 3-и сут культивирования, составляет соответственно 12 и 197 от числа 20 нанесенных, а количество культивируемых гепатоцитов 5,5-6,0 х 10 накг.Ф матрицы.П р и м е р 6. Условия проведения эксперимента, как в примере 1, за 25 исключением того, что углеродный сорбент, используемый в качестве матрицы, обладает объемом сорбционных пор .по бензолу 0,8 смэ /г и толщиной 3 мм, Количество неприкрепившихся при нанесении и выявленных в среде для культивирования гепатоцитов составляет на 2-е и 3-и сут культивирования 5,5 и ОЕ от числа нанесенных, В данном варианте на 1 мг матриць кульФтивируют 9-10 х 10 гепатоцитов.П р и м е р 7. Условия проведения эксперимента соответствуют примеру 1 эа исключением того, что углеродный сорбент, используемый в ка 40 честве матрицы, обладает объемом сорбционных пор по бензолу 1,2 см /г и толщинбй 3 мм, Количество не прикрепившихся при нанесении и выявленных в среде для культивирования геТаким образом, использование углеродных сорбентовнизкой емкости, структурированных в виде войлока толщиной 3-10 мм, покрытого предварительно коллагеном или полилиэином, позволяет осуществить прикрепление и глубинное культивирование. значительного количества изолированных клеток печени в малом объеме носителя. Количе