Способ получения полинуклеотид-сорбента

СОЮЗ СОВЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСК СПУБЛИ(51) 5 АНИ ЗОБРЕТ ВТОРСКОМУ С ЕПЬСТВУ госуддРственный НОмитетПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР(71) Всесоюзный научно-исследователь ский институт особо чистых биопрепаратов и Институт цитологии АН СССР (72) В.В.Константинов, Ю.П.Зеров и В,И.Божков(56) Сепе Ляяеп 1 Ыег Соигяе Рйагваса. Мо 1 еси 1 аг йо 1 оу Вшдяоп. Орряа 1 а Бжейеп, 1986.Веаисаде В.1 , СагпгЬегя М.Н. Тегга 11 ес 1 гоп Бегг. 1981, ч,22, У 20, р.1859-1862.Са 1 йаш Р.Т. МесЬос 1 я Епкупю 1. 197ч, 210, р.191-197Изобретение относится к молекулярной биологии и генетической инженерии и может быть использовано для получения полинуклеотидных сорбентовсо строго определенной последовательностью нуклеиновых оснований.Целью изобретения является повышение выхода по аффинату, увеличениедлины полинуклеотидов с заданной по"следовательностью, а также улучшениегидродинамических характеристик сорбента,В качестве твердофазного носителяиспользуют гранулированную целлюлозу,которую поперечно зашивают путем обработки эпихлоргидрином в водной щелочи при нагревании в атмосфере инер(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИНУКЛЕОТИДСОРБЕНТА(57) Изобретение относится к молекулярной биологии и генетической инженерии. Цель изобретения - повышениевыхода по аффинату, увеличение длиныполинуклеотидов с заданной последовательностью, Изобретение заключаетсяв использовании в качестве матрицыгранулированной целлюлозы. При этомцеллюлозу поперечно сшивают эпихлоргидрином. Затем частично модифицируют диметокситритилхлоридом. Избыточно ацилируют уксусным ангидридом.Синтез олигонуклеотид-сорбента ведутна ДНК-синтезаторе с последующим снятием защиты аминогрупп оснований иацетильной защиты целлюлозы обработкой концентрированным водным аммиатного газа. Целлюлозные гранулы высушивают азеотропной отгонкой водыс абсолютным пиридином в вакууме исуспендируют в абсолютном пиридине,Полученную суспензию обрабатываютдиметокситритилхлоридом в темнотепри комнатной температуре и, послепромывки абсолютным пиридином, избытком уксусного ангидрида в абсолютном пиридине. В результате такой обработки получают целлюлозную матрицу,у которой заданное число гидроксильных групп блокировано диметокситритильной защитой, а остальные гидроксильные группы этерифицированы осушатком уксусной кислоты. В таком видецеллюлозные гранулы помещают в реак 3157ционный проточный патрон, которыйвводят в синтезатор ДНК и ведут синтез полинуклеотида, начиная со стандартной процедуры удаления диметокситритильных групп целлюлозы, Деблокированные гидроксильные группыцеллюлозы далее конденсируют с Б-защищенным 5 -О-диметокситритил-дезоксинуклеозид-О-цианозтил-Б,Идизопропилам 1 но)-фосфоамидитом, синтезируя Фосфит-тризфирную связь между нуклеотидом и матрицей. Эта связьпосле стандартной процедуры окисления, предусмотренной фосфит-амиднымметодом, превращается в фосфотриэфирную и остается таковой во время синтеза всего полинуклеотида, проводимого по стандратной программе., Последующая обработка концентрированнымводным аммиаком.при нагревании приводит к полному деблокированию полинуклеотида, деацетилированию целлюлозной матрицы и превращению фосфотриэфирной связи носитель - полинуклеотидв фосфодиэфирную связь, стабильную вЭтих условиях,П р и м е р 1. К суспензии 10 мл(2,8 г) целлюлоэных гранул в 100 мл0,25 н, раствора БаОН, находящейсяв круглодонной колбе, добавляют 2,1 гэпихлоргидрина. Колбу помещают на роторный испаритель, откачивают воздухи заполняют внутреннее пространствоинертным газом (И , Аг), Под колбупомещают водяную баню с температурой60 С и перемешивают реакционную смесьв тецение 2 ц. Целлюлозные гранулы.промывают дистиллированной водой исуспендируют в 1 н. растворе ИаОН ватмосфере инертного газа в круглодонной колбе помещенной на роторный исопаритель, при температуре бани 100 Св течение 1 ч, После охлаждения докомнатной температуры целлюлозные гранулы промывают на фильтре дистиллированной водой, 0,1 н. НС 1. и снова водой до нейтрального рН, высушиваютазеотропной отгонкой воды с абсолютным пиридином в вакууме суспендируютв 10 мл абсолютного пиридина и добавляют 55 мг диметокситритилхлорида,Жидкую Фазу выпаривают в вакууме доисчезновения супернатанта и реакционную смесь выдерживают в течение 6 цпри комнатной температуре в темноте,К реакционной смеси добавляют 10 гуксусного ангидрида и 0 г абсолютного пиридина и оставляют при пере бг 36 40 45 50 55 10 5 20 25 ЗО 35 мешивании при комнатной температуре на 6 ч. Целлюлоэные гранулы промывают на фильтре абсолютным пиридином и хлористым метиленом. 70 мкл набухших в хлористом метилене целлюлоэных гранул помещают в реакционный проточный патрон синтезатора ДНК (;епе АввешЬ 1 ег фирмы нфармация" и проводят синтез полинуклеотида по стандартной программе.Синтезированная таким образом с выходом 721 олиго (д Т), -целлюлоза связывает в 0,5 М КС 1 +,5 м М трисНС 1-буфере 160-230 о.е, поли(А)-РНК на 1 г сухого сорбента.П р и м е р 2. По методу, описанному в примере 1, с увеличением длительности синтеза на приборе был синтезирован 56-мерный полинуклеотид последовательности 5 -ААААААААСТССТТ- ССССТСССАААТАТАТАТТТСООАССССААСгАСТТТТТТТТс выходом 301.Способ характеризуется большой технологичностью за счет сокращения трех стадий (удаление с матрицы и деблокирование, очистка, иммобилиэация на носителе). Причем иммобилиэация полинуклеотида за один (3 -) ко/ нец обеспечивает, максимальную доступность аффината с точки зрения комплементарных взаимодействий, Кроме того, способ обеспечивает высокий выход по аффинату, большую длину синтезируемых полинуклеотидов, синтез полинуклеотидов с любой заданной последовательностью, лучшие гидро- динамические характеристики сорбента, возможность автоматизации процесса,Формула изобретенияСпособ получения полинуклеотидсорбента, включающий синтез полинуклеотида, концевую иммобилизацию на целлюлозной матрице посредством ФосФодиэфирной связи и обработку концен- трированным водным аммиаком, о т л иц а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода по аффинату, увеличения длины полинуклеотидов с заданной последовательностью и улучшения гидродинамических характеристик сорбента, в качестве матрицы используют гра. нулированную целлюлозу, при этом целлюлозу предварительно модифицируют в атмосфере инертного газа снацала эпихлоргидрином в растворе ИаОН при 60 С в течение 2 ч при молярном соотоношении О-глюкозного звена целлюлозыПодписное Заказ 1829 Тираж 301 ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, ЖРаушская наб., д. 1/5Производственно-издательский комбинат "Патент, г.ужгород, ул,Гагарина, 101 1 5к эпихлоргидрину и ИаОН 1:1,3:1,4, затем избытком 1 н. ИаОН при 100 С в течение 1 ч, далее модифицированную целлюлозу обрабатывают в среде абсолютного пиридина последовательно диметокситритилхлоридом пои молярном 5765366соотношении Р-глюкозного звена целлюлозы к диметокситритилхлориду 106;1)и избытком уксусного ангидрида, а5синтез и иммобилизацию полинуклеотида осуществляют фосфит-амиднымтвердофазным методом,