Способ определения чувствительности мембран эритроцитов к свободнорадикальному окислению липидов

СОЮЗ СОВЕТСКИХшамаслйап 4 ИКРЕСПУБЛИК 034 15 А ащЯ 01 В 33/48, 33/52 ЛИСАН БРЕТЕНИЯ У К АВТОРСКОМ т тии ти с звоно-Ж в выделяют.нем при ачествегепарин - верхний ащяй;лейко- Полученалды отмыва ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЬЗТИПРИ ГКНТ СССР(71) Гродненский государственныймедицинский институт(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛНОСТИ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ К СВОБОНОРАДИКАЛЬНОМУ ОКИСЛЕНИЮ ЛИПИДОВ(57) Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано в эксперименте и клинике для Изобретение относится к области биологии и медицины, а именно к мето-, дам лабораторной диагностики, и может быть использовано в эксперименте и клинике для определения чувствитель-. ности эритроцитов к перекисному окис". лению липидов.Цель изобретения - повышение специфичности и физиологичности способа при одновременном его ускорении..Способ. осуществляют следующим образом.Из: 2 мп венозной кровиэритроциты центрифугирован300 я в течение 10 мин,вантикоагулянта используют200 ЕД/мл крови, Плазму ислой эритроцитов содержциты, удаляют отсасываниемый осадок эритропитоя пв 2определения чувствительности эритроцитов к перекисному окислению липидов. Цель - повьппение специфичност и физиологичности способа при одновременном его ускорении. Центрифугируют 2 мп венозной крови, 0,25 мп осадка эритроцитов смешивают с 2,4 мл физиологического раствора, добавляют спиртовой раствор витамина В,инкубируют 30 мин, затем добавляют 1,0 мл 50-ной трихлоруксусной кислоты, центрифугируют. К надосадочной жидкодобавляют раствор соляной кисло ыиобарбитуровой кислоты, кипятятпектрофотометрируют, Способ пот чаще определять наличие малоо диальдегида. ют, добавляя четырехкратный объем охлажденного физиологического раствора хлорида натрия и осаждая клетки центрифугированием при 300 я в течение 15 мин, Надосадочную жидкость вместе с верхним слоем эритроцитоввВ удаляют отсасыванием.0,25 мл осадка эритроцитов смешивают. ф с 2,4 мп забуференного физиологическо- Вф го раствора БаС 1 (50 мл 0,15 М фосфатного буфера рН 7,4 смешивают с 450 мл 0,9 Ж раствора ИаС 1) и 0,35 мл 0,5 Х спиртового раствора эргокальциферола (витамина 0), В контрольные пробирки вместо спиртового раствора файф витамина Э , добавляют равное количество эталона. Инкубацию проводят в течение 30 мин при 37 С в водной бане. После инкубации в пробы медленно добавляют, тщательно перемешивая,5610341,0 мп 50% трихлоруксусной кислоты.Пробирки центрифугируют 15 мии при 300 я. В чистые пробирки отбирают 2,0 мл надосадочной жидкости, к которой добавляют 0,2 мл 1 н.раствора соляной кислоты и 0,8 мл 0,12 М раствора тиобарбитуроной кислоты. После кипячения.в течение 10 мин жидкость приобретает розовую окраску, по интенсивности которой и судят о количестве образовавшегося малонового диальдегндаМДА) - в кювете 1 см определяют оптическую плотность раствора при 532 нм против контроля на ре.15 активыРасчет продукции МДА в эритроцитах осуществляют с использованием закона Бугера-Ламберта-Бера по Формуле: 20где С продукция ЩА вмпосадка эритроцитов зачинкубации;разность экстинкций опытной и контрольной пробна 532 нм;объем пробы для спектроФотометрирования;объем пробы после остановки инкубации;объем пробы, отобранныйдля постановки цветной ре-,акции;коэффициент пересчета времени инкубации;коэффициент пересчета на1 мл осадка эритроцитон; 40коэффициент молярной экстинкции, выраженный внм/мл (0,156),ДЕКзя К,К 28-33 мин продукция МДА почти 45достигает максимума и мало изменяет"ся при удлинении инкубации до 1 ч,В пределах интервала времени 28-33 минприрост продукции МДА является незначительным, поэтому Оптимальным вре менем инкубации следует считать 2833 мин,П р и м е р 1. Из 2 мл венознойкрови центрифугиронанием выделяютэритроциты, в качестне антикоагулянта55используют гепарин - 200 ЕД/мл крови.Плазму и верхний слой эритроцитов удаляют, Осадок эритроцитон дважды отмьгвают четырехкратным объемом охлажденного физиологического раствора хлорида натрия, осаждая клетки центрифугиронанием при 300 я в течение 15 мин.Надосадочную жидкость вместе с верхним слоем эритроцитов удаляют.0;25 мл осадка эритроцитон смешивают с 2,4 мп забуференного 0,9% раствора ИаС 1 и 0,35 мл 0,5% спиртовогораствора витамина Э , Конечная кон 2центрация 0,06%. В контрольные пробирки вместо спиртового раствора эргокальциферола добавляют равное количество этанола. Инкубацию проводятвтечение 30 мин при 37 ОС в водянойбане. После инкубации но все пробирки медленно добавляют, тщательно пе-ремешиная, 1, 0 мл 50% раствора трихлоруксусной кислоты. Пробирки центрифугируют 15 мин при 300 е. В чистые пробирки отбирают 2,0 мл надосадочной жидкости, к которой добанляют0,2 млн,раствора соляной кислотыи 0,8 мл 0,12 М раствора тиобарбитуроной кислоты, После кипячения н течение 1 0 мин наблюдают появление розовой окраски раствора, интенсивностькоторой измеряют спектрофотометрически при 532 нм против контроля на реактивы, По Формуле рассчитывают содержание МДА, которое в данном случаеравно 34,07 нМ/илч. Содержание МДАв эритроцитах этой же пробы крови,определенное по прототипу, составило37,84 нМ/мл ч.Процесс инкубации эритроцитов составил 30 мин противч (прототип)а вместо высокотоксичного и взрывоопасного азида натрия использован нетоксичный и невзрывоопасный эргокальциферол, что обеспечивает сокращениевремени и упрощение выполнения предла.гаемого способа,П р и м е р 2, Получают осадокэритроцитов, как указано н примере1, 0,25 мл осадка эритроцитов смешивают с 2,4 мп забуференного раствораИаС 1 и 0,35 мл 0,5% спиртового раствора эргокальциферола В контрольныепробирки вместо спиртового растворавитамина 0добавляют равное количест.но этанола, Инкубацию проводят н теочечне 28 мин при 37 С н водяной бане.Дальнейшая последовательность операций аналогична примеру 1, Спектрофотометрическая регистрация интенсивности розовой окраски раствора придлительности инкубации 28 мин и последующий пересчет показывают, чтомнлюмннесценцни мембран эритроцитов нмпlмнн Контроль (и = 12) Больные без холестаза(и 11) Больные с хопестазом (и = 16) 43,2612,72 36,9211,74 6875275,4 83, 693,82 79,1512,52 15217,4650,2 118,81+4,70" 201401678,1" 86, 0513, 75- достоверные различия по отношению к контролю(Р ( 0,05);- достоверные различия между группами бои цыТираж 525 Подписное Заказ 975 ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035,:осква, Ж, Раушская наб., д, 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул . Гагарина, 101 5 15 б количество МДА в данном случае равно 33,89 нМ/мл ч. Содержание МДА в эритроцитах этой же пробы крови, определенное по прототипу СоставиФло 37,59 нМ/мл ч.П р и м е р 3. Осадок эритроцитов получают аналогично примеру 1, 0,25 мл осадка эритроцитов смешивают с 2,4 мл забуференного физиологического раствора ИаС 1 и 0,35 мл 0,5 Х спиртового раствора эргокальциферола. В контрольные пробирки вместо эргокальциферола добавляют равное количество этанола. Инкубацию проводятов течение 33 мин при 37 С в водяной бане. Последующее выявление образовавшегося 1 ЯА проводят аналогично примеру 1. В данном случае при длительности инкубации 33 мин количество МДА равно 34,22 нМ/мп ч. Содержание МДА в эритроцитах этой же пробы крови, определенное по прототипу, составило 37,84 нМ/мл ч.Анализ, полученных данных свидетельствует, что при использовании предлагаемого способа у больных с холестазом определяется повьшенная продукция МДА,что подтверждается повышенным накоплением гидроперекисей),а при использовании прототипа подоб-,.ные изменения не были выявлены, Указанное подтверждает болыиую специ-.5фичность и физиологичность предлагаемого способа по отношению к известному техническому решению.В таблице приведены данные о продукции эритроцитарного МЦА и содержании гидроперекисей (определяют хемилюминесцентным методом) в мембранахэритроцитов больных вирусным гепатитом В средней степени тяжести (сболее тяжелым холестатическим вариантом заболевания и беэ него). Способ определения чувствитель ности мембран эритроцитов к свободнорадикальному окислению липидов путем их инкубации с прооксидантом, добавле" ния тиобарбитуровой кислоты и спектрофотометрирования, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения специфичности и физиологичности способа при одновременном его ускорении инкубацию проводят с раствором эргокальциферола в конечной концентрации 30,0,063 в течение 28-33 мин,