Способ выявления семян родительских форм в гибридных семенах кукурузы

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ 1542490 УБЛИ Н 10 51) ИЯ У н но-генетический А. Асыка лов и В огпцпаопаде веемго 1 е 1 пз, -дтеззЬа п о 1 Ьу 1.ап 198 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ПИСАНИЕ ИЗОБР АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛВСТВ(56) ОЬгпз б. Р. Реева 1 ег 1 а уре и ЬуЬгд гпеес 1 пс оспзз 1 пд о согпМгзсЬ, ЕогзсЬ. 37, Коп Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в селекции и семеноводстве кукурузы, в частности при создании гибридов.В настоящее время кукуруза выращивается преимущественно гибридными семенами, при получении которых раздельно производят семена отцовской и материнской форм по схемам первичного и элитного семеноводства, а затем в совместном посеве чередующимися рядами на изолированных участках получают гибридное потомство, высеваемое далее на производственных плошадях.Очень важно добиться чистоты родительских форм и выбраковать на участках гибридизации примеси родительских форм, а также обеспечить максимальную степень гибридности семян, собираемых с материнской формы.(54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ СЕМЯН РОДИТЕЛЬСКИХ ФОРМ В ГИБРИДНЫХ СЕМЕНАХ КУКУРУЗЫ(57) Изобретение относится к биотехнологии и может использоваться в селекции и семеноводстве кукурузы, в частности при создании гибридов. Целью изобретения является повышение точности выявления негибридных семян в гибридных, а также упрощение и ускорение анализа на чистоту гибридных семян. Способ состоит в том, что негибридные семена выявляют по электрофорегра мма м, полученны м в результате электрофоретического разделения зеинов в комбинированном полиакриламидном геле, включающем новый состав компонентов, При этом электрофорез проводится при обязательном соблюдении условий экстракции и нанесения зеинов, направленных на получение четких спектров. 1 з.п, ф-лы, 1 табл. Целью изобретения является увеличениеточности, упрощение и ускорение анализана содержание негибридных семян.Способ состоит в том, что чистоту гибридных семян определяют при помощиэлектрофоретического разделения усиков вкомбинированном полиакриламидном гелепри соблюдении ряда условий и операций,позволяющих получить четкие электрофореграммы, по которым легко выявить негибридные семена,Способ осуществляется следующим образом.На участках гибридизации спустя 3 - 4 недели после опыления (т. е. за 20 - 30 днейдо уборки) отбирают растения, с серединыпочатков которых вылущивают 3 зерна в отдельные пакеты. Все зерна после удалениязародыша измельчаются отдельно. Из полученного шрота извлекают зеин 70 О-ным2,0 0,3 100,048,0 50,0 1,0 До 100,0 40 3эталоном в течение 30 мин. Спиртовой экстракт белка высушивают в вакуумэксикаторе над КОН или МаОН или в вентилируемом сушильном шкафу при 40 С. Сухой остаток растворяют смесью, в 100 мл которой содержится 48 г мочевины, 0,6 мл уксусной кислоты и 5 мл меркаптоэтанола, и наносят (25 - 30 мкл) после 5 мин прогревания в закипевшей воде в ячейки стартовой части геля, предварительно заполненные раствором, содержащим 30 г моче вины и 0,6 мл уксусной кислоты в 100 мл объема. Гель готовят из компонентов, указанных ниже. Порядок смешивания - согласно очередности перечисления компонентов.15Соотношения компонентов для приготовления геля:Раствор метиленбисакриламида и акриламида(1 мг в 1 мл воды), млБидистиллированная вода, млНепосредственно перед заполнением пластин: Зо-ныйраствор персульфата калия, мл 1,0 или, если нет персульфата 35 калия, то свежеприготовленный 5 О"-ный растворперсульфата аммония, мл 0,5Электродный буфер;Ледяная уксусная кислота, мл 4,0Глицин,мг 400,0Дистиллированная вода, мл 1000,0Продолжительность электрофореза при напряжении 500 В 5 ч.Белки в геле фиксируют и окрашивают в растворе следующего состава: 200 мг кумаси бриллиантового К 250, 168 мл метанола, 58 мл уксусной кислоты, 100 мл 60 О"-ной ТХУ в 1000 мл воды. После 4 ч окраски гели отмывают обычной водопровод ной водой и перефотографируют на стеклянном столе с подсветкой.Полученные электрофореграммы зеина родительских форм и гибрида П 3978 свидетельствуют о кодоминантном характере наследования отдельных компонентов (у гибрида Е присутствуют все компоненты, характерные для обоих родителей, но с меньшей интенсивностью, обусловленной разной дозой гена). Наличие же у отцовской 4формы дополнительных (по сравнению с материнской формой) компонентов, которые четко проявляются в гибриде, позволяет использовать их при контроле гибридности семян первого поколения, Присутствие дополнительных компонентов или более интенсивное их выражение по отдельным зонам у материнской формы этого гибрида (линии П 346) позволяет обнаружить среди гибридных семян также семена отцовской формы (линии П 502) электрофореграммы которых по сравнению с таковыми гибридных семян лишены компонентов материнской формы.Пример. Для проверки действенности предлагаемого метода в отделе селекции и семеноводства кукурузы искусственно составлена смесь гибридных семян и семян материнской формы гибрида П 3978 - линии П 346, которые по внешнему виду различить невозможно. Эти семена с помощью данного способа анализировались в лаборатории биохимической генетики для выявления количества, семян материнской формы, добавленных к гибридным,Количество обнаруженных семян материнской формы (5 зерен из 100 анализируемых) полностью совпадает с умышленно добавленным.Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования электрофореграмм зеина для контроля степени гибридности семян кукурузы, выращиваемых на участках гибридизации. Это осуществимо в больших масштабах, так как данная методика отличается высокой точностью, воспроизводимостью и экспрессностью, требуемой для массовых анализов.формула изобретения 1, Способ выявления семян родительских форм в гибридных семенах кукурузы, включающий электрофорез в полиакриламидном геле извлеченного из зерна зеина, сопоставление электрофореграмм родительских и гибридных форм, отличающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения анализа, электрофорез проводят в комбинированном геле, который готовят из метиленбисакриламида, акриламида, ледяной уксусной кислоты, ТЕМЕДа, глицина, аскорбиновой кислоты, сернокислого закисного железа, персульфата калия, при этом перед электрофорезом высушивают зеин, затем растворяют его в смеси мочевины, уксусной кислоты и меркаптоэтанола, прогревают и наносят в ячейки стартовой части геля, предварительно заполненные раствором мочевины с уксусной кислотой, и далее после разделения зеинов по электрофореграммам проводят браковку негибридных семян.2. Способ по п. 1, отличающийся тем,что, с целью повышения точности анализа, комбинированный гель включает следующие1542490 Составитель В. ДемкинРедактор О. Спесивых Техред И, Верес Корректор Н. КорольЗаказ 355 Тираж 435 Поди исноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР1 3035, Москва, Ж - 35, Раушская наб., д. 4/5Производственно-издательский комбинат Патент, г. Ужгород, ул. Гагарина, 1 О ингредиенты: 10 г Акриламида, 0,25 г метиленбисакриламида, 2 мл уксусной кислоты, 03 мл ТЕМЕДа, 100 мг глицина, 48 г мочевины, 50 мг аскорбиновой кислоты, 1, мл 0,001 Я-ного раствора Ре 504 7 Н 20, 1,0 мл 3-ного раствора персульфата калия на 100 мл раствора, смесь для раство 6рения зеина состоит из следуюших ингредиентов: 48 г мочевины, 0,6 мл уксусной кислоты и 5 мл меркаптоэтанола на 100 мл раствора, раствор для заполнения ячеек состоит из следуюших ингредиентов: 30 г мочевины и 0,6 мл уксусной кислоты на 100 мл раствора.