Способ определения антигенов или антител

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН П 91 (111А 1- 14 пр ство СССР /53, 1987. видет ел 01 Иможет бытимму нных Из обре относится к м разо имеюхности ПАВ-датчю и измерительн а в и ни порн задержложке,формир ут уют ски цифич затем наносят известное ко лини ичество а орости распространщины слоя имеет вид ави сть т д я вол ны от ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИПРИ ГКНТ СССР ПИСАНИЕ ИЗО ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНОВИЛИ АНТИТЕЛ(57) Изобретение относится к области медицины и сельского хозяйства,а именно к иммунологии, ииспользовано при анализе и сельскому хозяиству, а именно к иммунологии, и может быть использо вано при анализе иммунных препарат на твердой поверхности.Целью изобретения является повы шение точности способа,Способ осуществляют следующим о азмещенные на однои подм адсорбции из раствораономолекулярный слой спеантигенов или антител,поверхность измерительн ализируемого раствора,интчик во влажной камере,4 С 01 Н 33/53 // С 01 М епаратов на твердой поверхности. Целью изобретения является повышение точности способа. Поставленная цель достигается тем, что на поверхности датчика, имеющего опорную и измерительную линии задержки на поверхностных акустических волнах,формируют монослой специфических анти- генов или антител, на поверхность измерительной линии наносят известное количество анализируемого раствора, инкубируют во влажной камере, промывают, высушивают, измеряют разность времен прохождения акустическсй волны в опорной и измерительной линиях задержки и по калибровочной йФ кривой находят количество специфических антител или антйгенов.1 табл. промывают, высушивают, после чего измеряют разность времен прохожденияакустической волны в опорной и измерительнои линиях задержки и по измеренной величине наносят количество фф исследуемого антитела или антигена по ранее построенной калибровочной М кривой. ЮДля доказательства применимостипредлагаемого способа необходимо показать, что приращения толщины молекулярных слоев за счет образования ч иммунных комплексов достаточно для изменения скорости поверхностнойакустической волны, причем настолько,чтобы была возможность это изменениеизмерить.1 Ч - Ч(Ь) /Ч =2 нРЬ/Ч где Ч, Ч(Ь) - скорости поверхностнойволны на свободной ипокрытой слоем поверхнос ти;коэффициент, хара кт еризующий цисперсионные свойства слоистой системы;Г - рабочая частота ПАВдатчика.Если использовать ПАВ в датч в качестве частотозадающего элементаавтогенератора, то при изменении ско -рости Ч относительное изменение частоты генератора Г будет составлять Р - Г(Ь) Ч - Ч(Ь) Р Ч20 Следовательно, относительное изменение скорости может регистрироваться с тем же разрешением, с каким регистрируется относительное изменение частоты, т.е. на уровне 10 - 10Чувствительность к толщине, рас - считанная по формулам, для слоев с т ".-10и пьезокварцевых датчиков У,Х-среза (Ч = 3159 м/с) с частотами 10 и 100 МГц равна 20 и 2000 Гц/нм соответственно. Отсюда следует, что ,минимально регистрируемые приращения толщины л Ь р,составят 10 35 1 О м, что находится на уровне элип,с ометрич еского метода, предложенного в прототипе.Повысить чувствительность можно путем увеличения частоты ПАВ - датчи ка. Современная технология обеспечивает возможность создания ПАВ-датчиков, частоты которых могут лежать в диапазоне до 1 ГГц.П р и м е р 1. Определение коли ч ества и нсули на в раствор е.Использовались ПАВ-датчики с дву - мя линиями задержки на пьезокварцевом кристалле У,Х-среза, основ - ная чистота 10 МГц,50Разведение всех компонентов реакции проводят на 0,01 М фосфатном буфере (ФБ) с рН 7 4.Этап А. ПАВ-датчик вносят в раствор иммуноглобулинов с концентрацией 10 мкг/мл, выделенныхиз антиинсулиновой сыворотки морской свинки, инкуо бируют в течение ночи приф 4 С,промывают датчик, не вынимая из раствораРаствор Расчетная Измеряемаяконцентрация, раз иост ьмкг/мл частот, Гц 1 2 3 4 5 6 8 8 210,0 180,5 149,0 105,0 78,0 57,626,36,6 340 268 210, 166 128 8335 12 П р и м е р 2, Определение копичества антител в сыворотке. 100 мл ФБсодержащего 0,053 твина(ТФБ), вынимают из раствора и обдувают его рабочую поверхность струей инертного, газа для удаления капель ТФБ.Этап Б. На поверхность одной из линий задержки наносят 100 мкл анализируемого раствора, разведенного в ТФБ,Инкубируют во влажной камере при 37 ОС 2 ч. Затем поверхность датчика отмывают от несвязавшихся молекул инсулина 100 мп ФБ и 100 мл дистиллированной воды. Сушку датчика производят в среде, осушенной селикагелем до тех пор, пока измеряемая частота разностного сигнала в опорной и измерительной линиях задержки повторится не менее 10 раз подряд. Измерение проводят путем включения датчика в цепь обратной связи усилителя,возбуждающегося на частоте, определяемой временем задержки ПАВ-датчика.В таблице представлены результаты проведенного анализа (приведенные значения являются средними по результатам двух измерений).Один датчик можно использовать для проведения двуханализов, не повторяя этап А, для чего аликвоту анализируемого раствора нанОсят на поверхность опорной линии задержки, а измерительную используют в качестве опорной. Затем необходимо поверхность датчика очистить от продуктов реакции. Очистку производят путем выдерживания датчика в 10 Е-ном водном растворе тринатрийфосфата в течение 1 ч при комнатной температуре с последующим промыванием в дистиллированной воде.14 78122 Составитель П. БонарцевТехред Л.Олийнык Корректор С. НеРни Редактор С. Пекарь Заказ 2357/44 Тираж 790 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГЕНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно в издательск комбинат "Патент", г.ужгород, ул, Гагарина, 101 Использовались ПАВ-датчики У,Х- среза, с частотой 10 МГц и классы 1 С, 1 яМ, 1 яА, выпускаемые ИЭМ им. П.Ф. Гамалея АМН СССР.Этап А, Для адсорбции антигена на поверхность датчиков готовят раствор чистых 1 яС в ФБ с концентрацией 10 мкг/мл. ПАВ-датчики вносят в приготовленный раствор и инкубируют 1 О в течение ночи при4 С. Промывают датчики, не вынимая из раствора, 100 мл ТФБ, затем вынимают датчики из раствора и обдувают рабочую поверхность очищенной струей инертного газа.Этап Б. На поверхность измери - тельных линий задержки наносят по 100 мкл исследуемого раствора сыворотки различных разведений, Разведе ния сывороток готовят в ТФБ. Инкубируют сыворотки с адсорбированным иммуноглобулином 1 ч при 37 С. Для исключения влияния качества промывки на результат измерения,и контроля 25 специфичности реакции на опорные линии задержки наносят по 100 мкл контрольного раствора сыворотки без анализируемых антител. После инкубации поверхность датчика отмывают от 30 несвязавшихся антител 100 мл ФБ и дистиллированной воды. Сушку и измерение проводят по примеру 1.Уровень антител в исследуемых сыворотках оценивают по калибровочному графику зависимости частоты разност 35 ного сигнала от разведения контроль - ных сывороток.Таким образом, из приведенных примеров следует, что чувствительность предлагаемого способа при использовании ПАВ-датчиков с частотой 10 МГц и точности регистрации частоты 1 Гц составила 0,5 мкг/мл, что не хуже,чем в прототипе. Однако, как следует из описания изобретения, повышение чувствительности не менее, чем на 2 порядка, представляет собой чисто техническую задачу, связанную с повышением рабочей частоты ПАВ-датчика до 1 ГГц.Кроме того, предварительная подготовка датчиков по этапу А, например использование готовых иммунологических наборов, позволяет значительно сократить время анализаЕсли сравнить время этапа Б, затраченное на исследование восьми растворов в двух повторностях для прототипа и предлагаемого способа, то окажется, что для прототипа требуется на 5 ч больше. Поэтому технико-экономические преимущества изобретения по сравнению с прототипом являются очевидными.Формула и з обр ет ения Способ определения антигенов или антител путем иммобилизации на твердой поверхности датчика антител или антигенов с последующим нанесением исследуемого раствора, инкубацией, промыванием, высушиванием, измерением акустических характеристик и определением количества антигенов или антител по калибровочной кривой,о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения точности способа, исследуемый и контрольный растворы наносят соответственно на поверхность датчика в области измерительной и опорной линий задержки акустических волн, а измерение акустических характеристик осуществляют по разности времени прохождения акустической волны в опорной и измерительной линиях задержки.