Способ подготовки бактерий для электронно-микроскопического исследования

(51)4 С 01 Н 1/ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯН А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ довательробиоло 0 ( т шав сопйецс 1 ещце. - р.597 Л.И. апд ,1 аг 1 йогв 11. ггазггисиге ог СЬе вагцщ ро 1 усерЬа 1 цв.е 11, 1972, ч. 4(1), Р 1 ав Ъапе 1шойа 1 и 1сее. РВУвце апй с36.(57) Изоб шухошу Т 1 в 15 ОБ ПОДГОТОВКИ БАКТЕРИЙ О-МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ИС СЛЕцОретение относится к 2Ацетат-вероналовыибуфер (рН 6,0) Остальноепри ком-,суспенрастворшенин55 мин успензиюок двгидрациин) 70%мин; 95% иловый ОСУДАРСТ 8 ЕННЫИ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР(56) Куег А. еГа 1. ЕСцйе ап шхсговсоре е 1 есСгоп 11 ие йе р 1 авпапг йе 11 асЫе йевохугьЬопЕ,ЧагцггогсЬ, 1958, ч.138,609. 1Изобретение относится к микробиологии, в частности к методам электронной микроскопии бактерий.Цель изобретения - сокращение длительности подготовки бактерий для электронной микроскопии.П р и м е р 1. Бактерии ЕвсЬегь-., сМа со 11 К, выращенные на плотной среде, петлей (3-4 петли) переносят в пробирку с фиксирующей смесью следующего состава, мас.%:Глутаральдегид 2Уранилацетат 0,5 Хлористый кальций 0,11 биологии, в частности к методам электронной микроскопии бактерЮ Цельюизобретения является сокращение длительности подготовки бактерий дляэлектронной микроскопии. Фиксацию бактерий осуществляют в течение 510 мин в смеси следующего состава,мас.%: глутаральдегид 2,0-2,5; урвацетат 0,5-0,6; хлористый кальций, 11-0, 12; ацетат-вероиаловый буферрН 6,0-6,2) - остальное, затем вечение 50-55 мин после добавленияк указанной смеси 3-4%-ного водногораствора четырехокиси осмия в соотношении 1:1, пропитку проводят втрех сменах абсрлютного спирта и аралдита или пропиленоксида и эпона приих соотношении (1-3):(3-1) в течение1,5-2 ч при 35-37 С и затем в смолев течение 1,5-2 ч в вакууме 133,32 хх 10Па при 35-37 С. После этого в течение 14-16 ч проводят полимвризацию при 70-90 С,и фиксируют в течение 5 миннатной температуре. Затем кзии добавляют 3%-ный водныйчвтырехокиси осмия в соотн1:1 и дофиксируют в течениепри комнатной температуре.клеток центрифугируют и осадратируют в градиенте концвнэтилового спирта: (50% 10 ми10 мин; 80% 10 мин; 90% 1010 мин; 100% (абсолютный этюП р и м е р 2. Бактерии Е.Со 1 х -12, выращенные на плотной среде, 25 етлей переносят в 3 мл фиксирующей меси, состоящей из следующих компонентов, мас, :Глут ар апьд егид 2,5Уранилацетат 0,6Хлористый кальций 012Ацетат-вероналовыйбуфер (рН 6,2) Остальное и Фиксируют в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем к суспен,зии добавляют 4 -ный водный раствор четырехокиси осмия в соотношении 1: 1 и дофиксируют в течение 50 мин при комнатной температуре, Дегидратацию образцов проводят аналогично примеру 40 1. Пропитывают клетки в трех сменах абсолютного этилового спирта и аралдита в соотнощениях 3: 1 1: 1, 1:3 при 35 С по 2 ч в каждой. Затем образцы переносят в чистый аралдит и 4 выдерживают в вакууме (10торр) 2 ч при 35 С. Заключают образцы в аралдит и полимеризуют при 80 С 16 ч.Предлагаемый способ позволяет за 27 ч подготовить бактерии к ультра- структурным исследованиям.Тонкая структура клеток Е.Со 1 ь, препарированных с помощью этого способа, качественно сохранена.П р и м е р 3. Используют бактерии 18-часовой культуры К, выращенные на жидкой питательной среде. Примерно 2-3 мл суспензии клеток центрифугируют и осадок суспензируют 30 3 146574 спирт) 20 мин (3 смены). Пропитывают образцы в трех сменах абсолютного этилового спирта и аралдита в соотношениях 3: 1, 1: 1, 1;3 при 37 С по 1,5 ч в каждой, затем переносят в чистый аралдит и выдерживают в вакууме (10торр) 1,5 ч при 37 С. Заючают образцы в аралдит и полимериуют при 90 С в течение 14 ч.10Предлагаемый способ Фиксации и репарирования бактерий позволяеттечение 23 ч подготовить клетки к лектронно-микроскопическим исследо аниям.Изучение срезов бактерий Е.Со 1.электронной микроскопе показало, то тонкая структура клеток качестенно сохранена. На срезах выявляются 20 се ультраструктурные элементы клети. 04В 3 мл смесир состоящей из следующих компонентов, мас. :Глутаральдегид 2Уранилацетат 0,5Хлористый кальций 0,11Ацетат -вероналовыйбуфер (рН 6, 0) Остальное и фиксируют в течение 7 мин при комнатной температуре.Дофиксируют и дегидратируют аналогично примеру 1. Дегидратированные клетки выдерживают в пропиленоксиде 10 мин при комнатной температуре. Пропитывают в трех сменах пропиленоксида и эпона при их соотношениях 3:1, 1:1, 1:3 при 37 С по 1,5 ч в каждой. Затем образцы переносят в эпон и выдерживают в вакууме (10 " торр) 1 5 ч при 37 С, Заключают образцы в Эо эпон и полимериэуют при 70 С в течение 15 ч.Фиксацию и препарирование бактерий для электронно-микроскопических исследований проводят в течение 24 ч. Способ обеспечивает сохранность улвтраструктуры бактерий.П р и м е р 4, Бактерии Е.Со 1 ь Кфиксируют, дофиксируют, дегидратируют аналогично примеру 2.Пропитывают в трех сменах пропиленоксида и эпона в соотношениях 3: 1, 1:1, 1:3 при 37 С по 2 ч в каждой. Затем образцы переносят в эпон и вьдерживают в вакууме (10торр) 2 ч при 37 С. Заключают образцы в эпок и полимеризуют при 90 С в течение 14 ч.Исследование в электронном микроскопе ультратонких срезов Е.Со 1 ь показало, что тонкая структура качественно сохранена.На фиксацию и препарирование бак терий затрачивают 23 ч.П р н м е р 5. Бактерии Е.Со 11 К-. 12 фиксируют, дофиксируют, дегидратируют, пропитывают и заключают аналогично примерам 1-4. Полнмеризацию образцов проводят при 65 С в течение 15 ч.Было обнаружено, что полимеризация образцов при 65 С в течение 15 ч является недостаточной, блоки имеют. мягкую консистенцию и плохо режутся на ультрамикротоме.П р и м е р 6. Бактерии Васд 11 ив Ьогхпд:1 епзьз шт,-52, выращенные на плотной среде 72 ч при 37 С, фиксио руют, дофиксируют, дегидратируют,65740 бранена, На срезах отчетливо выявляются все ультраструктурные элементы споровых клеток,Составитель И.ТарееваТехред Л.Сердюкова Корректор М.Васильева Редактор А.Огар Заказ 936/42 Тираж 788 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 5 14пропитывают, заключают и полимеризуют аналогично примеру 1,Электронно-микроскопическое изучение ультратоиких срезов спор Вас.СЬигпаепз 1 з показало, что тонкаяструктура споровых клеток качественно сохранена. Выявляются все ультраструктурные элементы спор.П р и м е р 7. Бактерии Вас.сЬогдпддепзз шт.-52, выращенные нажидкой среде, фиксируют, дофиксируют,дегидратируют, пропитывают, полимвризуют аналогично примеру 3.Ультраструктура споровых клетокВас, СЬигдпддепзз, фиксированных ипрепарированных по предлагаемой методике, качественно сохранена.П р и м е р 8. Бактерии ВасьПцаврр, шт.-18, выращенные на плотнойсреде в течение 48 ч при 37 С, фиксируют, дофиксируют, дегидратируют,пропитывают, заключают и полимеризуют аналогично примеру 2.Ультраструктура вегвтативных кле-ток, проспор и спор Вас, зрр. шт.-18качественно сохраняется.П. р и м е р 9. Бактериальныеклетки Вас 11 из зрр. шт.-18 фиксируют, дофиксируют, дегидратируют,пропитывают, заключают и полимеризуют аналогично примеру 4Структура споровых клеток Вас,врр. шт.-8,препарированных по предлагаемому способу, качественно сох 5 формула изобретения Способ подготовки бактерий дляэлектронно-микроскопического исследования, включающий фиксацию, двгидратацию, пропитку и заключение в эпоксидные смолы с последуннцей полимвриэацией, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью сокращения длительности подготовки, фиксацию осуществляют з две стадии - вначале втечение 5-О мин в смеси следуницегосостава, мас.ь:Глутаральдегид 2,0-2,5 20 Уранилацетат Ов 5-ОфбХлористый кальций О, 11-0, 12Ацетат-вероналовыйбуфер рН 6,0-6,2 Остальноеа затем в течение 50-55 мин после 25 добавления к указанной смеси 3-4 Хного водного раствора чвтырвхокисиосмия в соотношении 1:1, пропиткупроводят в трех сменах абсолютногоспирта и аралдита или пропилвно- ЗО ксида и эпона при их соотношбнии1-3:3-1 в течение 1,5-2 ч при 3537 С и затем в смоле в течение 1,52 ч в вакууме 133,32 "1 ОПа при35-37 С, а полимеризацию осущвствляо З 6 ют в течение 4-16 ч при 70-90 С.