Способ определения чувствительности замедленного типа к микробам

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК144291 19 р 5 Н 4 С 01 И 33/48 НИЕ ИЗОБРЕТЕНИ ны ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО.ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ(56) Новиков Д.К., Новикова В,И. ,Клеточные методы иммунодиагностики. Минск: Беларусь, 1979, с. 117-136. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬ НОСТИ ЗАМЕДЛЕННОГО ТИПА К МИКРОБАМ (57) Изобретение относится к медици касается аллергопогии и иммучологии С целью повышения точности способа и сокращения сроков проведения анализа из лимфоидных органов и периферической крови сенсибилизированныхморских свииок получают суспензиилимфоцитов, дважды отмывают их всреде 199 и доводят концентрацию до2 10/млСоединяют равные объемылимфоцитов и эритроцитов кролика вконцентрации 100 10 /мп (маркер Тклеток морской свинки), инкубируют5-10 мин при 37 С, 5 мин центрифугируют при 20 С, вьдерживают 1 ч при4 С и учитывают результаты реакции.Для этого осадок ресуспендируют, каплю смеси помещают в счетную камеру е, и под световым микроскопом с увеличением х 200 подсчитывают число розеток (лимфоцит с 3 и более прикрепленми эритроцитами) на 100 лимфонитовэ ЩИзобретение относится к биологиии медицине, а именно к аллергологиии иммунологии.Цель изобретения - повышение точности способа и сокращение срокованализа,Способ осуществляют следующим образом.Иэ лимфоидных органов и пери 0 ерической крови сенсибилизированных морских свинок получают чистые суспензиилимфоцитов. Тимус и селезенку илилимфоузлы (выборочно) гомогенизируют, Фильтруют через двойной слой капронокой сетки. Лимфоциты периферической крови выделяют в градиентеплотности Фиколл-верографин, (плотность 1,077 г/мл). Затем суспензиилимфоцитов дважды отмывают средой 20199, доводят концентрацию до 2 107 мпСоединяют равные объемы лимфоцитов иэритроцитов кролика в концентрации100 х 10 /мл (маркер Т-клеток морскойсвинки), инкубируют 5-10 мин при37 С, центрифугируют 5 мин при 20 С,выдерживают при 4 С 1 ч, после чегоучитывают результат реакции. Для этоо осадок ресуспендируют, каплю смеси помещают в счетную камеру и в 30световом микроскопе с увеличениемх 200 подсчитывают число розеток(лимфоцит с 3 и более прикрепленнымиэритроцитами) на 100 лимфоцитов,Для диагностики повьппенной чувствительности замедленного типа(ПЧЗТ) достаточно определить количество Т-клеток в тимусе и в одном изпериферических лимфоидных органов:селезенке, лимфоузлах или крови. 40П р и м е р 1. Морских свинок сенсибилизируют введением 5 млрд микробных клеток в смеси с неполным адъювантом Фрейнда в подушечки задних лап,Сенсибипизацию морских свинок осуществляют введением следуюпдх микроорганизмов: 6-гемолитического стрептококка группы А; золотистого эпидермального и сапрофитического стафилококков. На высоте сенсибилизации (через 4-5 недель) определяют количество Т-клеток в лимфоидных органах икрови, ставят кожно-аллергические реакции замедленного типа и реакцииторможения миграции лейкоцитов(РТМЛ),Дополнительно проводят общепринятые кожно-аллергические реакции замедленного типа на внутрикожное введение специфических аллергенов и реакцию торможения миграции лейкоцитов по известному способу под действием соответствующих аллергенов, которые были положительными при учете через 24 ч у животных, сенсибилизированных всеми используемыми в опытах микроорганизмами, Т.е. по данным этих тестов у животных всех групп индуцировалась ПЧЗТ. При использовании же предлагаемого способа статически значимое снижение количества Т-клеток в тимусе и повьппение их числа вселезенке, лимфоузлах и крови наблюдалось только у морских свинок, сенсибилиэированных стрептококком гемолитическим и стафилококком золотистым,Для подтверждения достоверностирезультатов, полученных по предлагаемому способу, быпо проведено гистоморфологическое и гистохимическоеисследования на наличие ПЧЗТ в исследованных группах животных. По данным гистоморфологии, ПЧЗТ формировалась только у животных, сенсибилизированных В-гемолитическим стрептококком и золотистым стафилококком. Марфофункциональные изменения у морскихсвинок этих групп характеризовалисьсистемными стереотипными реакциямисосудов преимущественно венозного типа, активацией клеток соединительнойткани и появлением однородных мононуклеарных инфильтратов. Типична картина деструктивного эндоваскулита,некротизирующего мезеваскулита ипродуктивного периваскулита, формирование которого обусловлено муфтообразными скоплениями сенсибилизированных Т-лимфоцитов, моноцитов и макрофагов, Кроме того, реакция ПЧЗТдокументируется иммуноморфологическими перестройками в лимфоидной системе с активацией клеток зон - представителей Т-лимфоцитов и высокой ихпролиферацией, а также повышенноймиграцией через посткапиллярные венулы, в связи с чем имелись очагиделимфатизации. У морских свинок,сенсибилизированных эпидермальным исапрофитическим стафилококками, невыявлено морфологических изменений,характерных для ПЧЗТ. У этих животныхустановлены сосудисто- воспалительные изменения во всех органах, В очагах воспаления вокруг сосудов и встроме формировались инФильтраты изФормула изобретения Составитель В,ЛитовченкоРедактор Е.Папп Техред Л.Сердюкова Корректор Л.Пилипенко Заказ 6379/42 Тираж 847 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 з14429 полиморфноядерных лейкоцитов (ПМЯЛ) и макрофагов, отражающие выраженность воспалительного процесса, В лимфоидной системе обнаруживалась картина5 невыраженных тимусзависимых и тимуснезависимых зон, среди клеток в которых имелись ПМЯЛ. Через высокий эндотелий посткапиллярных венул мигрировали ПМЯЛ и лимфоциты. С использованием предлагаемого способа анализ осуществляют в течение 2-3 ч, в то же время по известному затрачивается 18-24 ч,Упрощение способа по сравнению с известным заключается в том, что исключается этап инкубации выделенных лимфоцитов с исследуемым микробом. Таким образом, предлагаемый способ 20 диагностики ПЧЗТ по наличию совокупности признаков - снижению числа Т- лимфоцитов в тимусе и повышению в одном из периферических лимфоидных органов или крови - достоверно коррели рует с результатами гистоморфологи 184ческого исследования в отличие от кожных проб и РТМЛ и позволяет проводить диагностику ПЧЗТ эффективно, быстро и относительно просто. Способ определения чувствительности замедленного типа к микробам, включающий сенсибилизацию животных исследуемыми микробами, забор крови, выделение лейкоцитов с последующим иммунологическим исследованием, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью сокращения сроков анализа и упрощения способа, у животного дополнительно выделяют лейкоциты из тимуса, селезенки, или пахового, или шейного лимфоузлов, определяют уровень Т-лимфоцитов в реакции розеткообразования и по снижению количества Т-лимфоцитов в тимусе и по повышению их числа в селезенке или в лимфоузлах, или в крови определяют наличие чувствительности замедленного типа.