Способ подготовки к исследованию инвазионного материала

ОЮЗ СОВЕТСНИХОЦИАЛИСТИЧЕСНИРЕСПУБЛИК А 1 9) 01 1) 4 С 01 Я 33/48 НИЯ У 26аучно-исследо гельминтолог ТОВКИ К ИССЛЕДОИАТЕРИАЛАотносится ки ветеринартановления а биологии,ии, преднтихо н СУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ССС О ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕ АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(54) СПОСОБ ПОДГОНИЮ ИНВАЗИОННОГО(57) Изобретениекасается медициныазначено,) для ус ик и Д.А;Пакятурене(088.8) Н М." СЬо 1 певгегав вег 1 ев оГ шопоятарЬ рр 1).ей Ьдо 1 о 8 у, 1959линэстерального механизма действия антигельминтиков и целенаправленного отбора средств, парализующих функ. ции нервно-мышечного аппарата гелвминтов Цель изобретения - упрощение и ускорение способа исследования за счет сокращения количества стадий. Для этого половозрелые гелвминты промывают в теплом (37 С) физрастворео,и фиксируют 24 ч в 103"ном растворе формалина, приготовленном на физрастворе. После фиксации промывают в физ" растворе с частой сменой его .(каждые 10 мин) . Перед помещением в Йнкуба-ч" ционную среду фасциол споласкивают дистиллированной водой. Инкубацию проводят 24 ч при 18-22 С.Изобретение относится к биологии,в частности к медицине и ветеринарии,и может быть использовано для установления антихолинэстерального механизмадействия антигельминтиков и целенаправленного отбора средств, парализующих функции нервно-мышечного аппарата гельминтов.Цель изобретения - упрощение иускорение способа исследования засчет сокращения количества стадий.Способ осуществляют следующимобразом.Материалом для исследования слу".жат подвижные половозрелые гельминты, которых сразу же после извлечения.промывают в теплом ( 37 С 7 физрастворе, фиксируют в течение 24 чв 107,-ном. растворе формалина, приготовленном на физрастворе, ПослеФиксации промывают 6 ч в физрастворе с частой его сменой (каждые 10 мин)Перед помещением в инкубационнуюсреду Фасциол споласкивают дистиллированной водой.Инкубационную среду готовят передупотреблением, используя заранее заготовленные навески, которые могутпродолжительно храниться. На 1 половозрелый организм расходуют 1 порциюинкубационной среды, в которую егопомещают целиком (беэ изготовлениясрезов) . Для получения 1 порции(5,45 мл) инкубационной среды с рН5,6-5,8 сначала готовят 1,6 мл бу 35фера, растворяют заранее заготовленные навески (135 мг ацетата натрияв 1,5 мл дистиллированной воды) идобавляют 0,15 мл раствора уксуснойкислоты, приготовленной тут же путемразведения 0,03 мл ледяной уксуснойкислоты в 1 мл дистиллированной во-ды. Иэ остальных навесок ингредиентов среды также готовят растворы из45расчета на 1 мл дистиллированной воды; 20 мг ацетата меди, 19 мл гликокола, 7 мг ацетилтиохолина (АТХ),Далее в стаканчик с 1,6 мл буферадобавляют О,1 мл раствора ацетатамеди, 0,2 мл раствора гликокола,фильтрованный раствор субстрата и2,5 мл дистиллированной воды. Для получения фильтрованного раствора субстрата к 1 мл растворенного АТХ добавляют О, 13 мл раствора ацетата меди и 55спустя 3 мин фильтруют его через смоченный водой фильтр. Инкубацию проводят24 ч при комнатной температуре,Для оценки активности холинэстера-. зы в различных ткаиевых структурах необходима обработка фасциол 1 Х-ным раствором сульфида натрия, благодаря чему белого цвета осадки конечного. продукта реакции - тиохолина меди - в местах нахождения холинэстеразы окрашиваются от светло-коричневого (слабая активность) до черного цвета (высокая активность).После многократной промыйки в дис" тиллированной воде (в течение 20 мин) Фасциол, обработанный 1 Х-ным раствором сульфида натрия (или необработанный им) Фиксируют 18 ч в 207-ном растворе формалина, снова. промывают 20 мин в воде и помещают для просвет" ления и хранения в 757-ный водный раствор глицерина, который легко от" мывается водой, не влияя отрицатель" но на последующий этап обработки сульфидом натрия в случае хранения "не проявленных" 1 не обработанных им ранее) фасциол.П р и м е р 1 . Материалом для ис" следования служат подвижные полово- зрелые печеночные сосальщики Мсгосое 1 ыш 1 апсеаТцш, которых сразу же после извлечения из печени промывают в теплом (37 С) физрастворе, фик" сируют в течение 24 ч в 1 07-ном растворе. формалина, приготовленном на физрастворе. После фиксации дикроцелиев промывают 3 ч в физрастворе с частой его сменой (каждые 20 мин). Перед помещением в инкубационную среду дикроцелиев споласкивают дистиллированной водой.Инкубационную среду готовят такде как в примере 1, На 10 половозрелых дикроцелиев расходуют 1 порцию инкубационной среды, в которую их помещают целиком (без изготовления срезов) . Инкубацию проводят 24 ч при комнатной температуре.Для оценки активности холинэстеразы в различных тканевых структурах необходима обработка дикроцелиев 1 -ным раствором сульфида натрия, благодаря чему белого цвета осадки тиохолина меди в местах нахождения холинэстеразы окрашиваются от светло-коричневого (слабая активность) до черного цвета (высокая активность):После иногократной промывки в дистиллированной воде (в течение 20 мин) дикроцелиев, обработанных 17.-ным раствором сульфида натрия (или необ1409927 Формула изобретения Способ подготовки к исследованиюинвазионного материала путем взятиябиообъекта, фиксации, промывки, приготовления серийных срезов, окрашивания с применением сернистого натрия,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью упрощения и ускорения способаза счет сокращения количества стадий,промывку ведут 3-6 ча окрашиваниепроводят при комнатной температурев цельном биообъекте,Составитель Е.Колмакова Редактор И,Касарда Техред М.Дидык Корректор М.Шароши, Заказ 3474/40 Тираж 847 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 45 Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4 работанных им), фиксируют 6 ч в 207, -ном растворе формалина, снова промывают 20 мин в воде, и помещают дляпросветления и хранения в 753-ный5водный раствор глицерина, которыйлегко отмывается водой, не влияяотрицательно на последующий этап обработки сульфидом натрия в случаехранения не обработанных им ранее 10"непроявленных" дикроцелиев.П р и м е р 2. Материалом для исследования служат половозрелые фасциолы, извлеченные из печени двухэкспериментально зараженных овец литовской черноголовой породы, однойиз которых через рот был введен однократно ацемидофен в дозе 150 мг/кг,а другая служила нелеченным котролем.Обе овцы были убиты спустя 28 ч после дегельминтизации первой из них.Фасциол, извлеченный из печени, промывают в теплом 37 С) физрастворе ификсируют 24 ч в 103-ном раствореформалина на физрастворе, затем промывают их в физрастворе в течение6 ч, сменяя его каждые 10 мин. Передйомещением в инкубационную среду фасциолополаскивают дистиллированной водой. Приготовление З 0инкубационной среды, а также процесспроведения гистохимической реакциитакие же, как в примере 1,Об антихолинэстеразном действии ацемидофена на нервно-мышечный аппарат фасциол судят по разнице в интенсивности окраски ферментосодержащих структур у интактных и подвергшихся действию ацемидофена трематод Устанавливают, что ацемидофен избиратель" но действует на ротовой аппарат . фасциол, угнетая холинэстеразу в тканях ротовой присоски и полностью ингибируя ее в тканях глотки. В связи с этим не только нарушаются пищеварительная и эвакуаторная функции, но фасциолы утрачивают способность прикрепляться к тканям хозяина и вымываются из печени током желчи еще живыми, но парализованными.