Способ определения состояния рецепторного аппарата клеток

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИК ЯО 138 504 О О И 33/5 АНИЕ ИЗОБРЕТЕ 4,л. 11 10нкологичСРа и А.Е.8)ч, 288 ии на Орешк, И 5792,ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(1) Всесоюзныйный центр АМН С(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОСТОЯНИЯ РЕЦЕПТОРНОГО АППАРАТА КЛЕТОК(57) Изобретение относится к биологии. Для определения состояния рецепторного аппарата клеток рецепторы, находящиеся на поверхности клеток, связывают с транскобаламин- кобаламиновым комплексом, содержащимлкобаламин, меченый Со. Меченые рецепторы удаляют с поверхности клеток папаином. Клетки осаждают центрифугированием количество рецепторов и кобаламипа, вступившего в клетку, определяют путем измерения радиоактивности и дальнейшего расчета.Изобретение относится к биологиии может быть использовано в биохимиипри исследовании поверхностных ре цепторов к транскобаламин-кобал аминовому комплексу,Цель изобретения состоит в, создании способа определения состояниярецепторного аппарата клеток, заключающегося в количественном определении рецейторов к транскобаламинкабаламиновому комплексу при одновременном расчете суммарного количества кобаламина, поступившего в клетку за определенный промежуток времени.Указанная цель достигается тем,что в предложенном способе рецепторы,находящиеся на поверхности клеток,связывают с транскобаламин- кобаламиновым комплексом, содержащим кобаламин, меченый радиоактивным Со57Меченые таким образом рецепторыудаляют с поверхности клеток папаином. Клетки осаждают центрифугированием, количество рецепторов и кобаламина, поступившего в клетку, определяют путем измерения радиоактивности и дальнейшего расчета.П р и м е р. Для определения рецепторного аппарата клеток готовятстандартную сыворотку из богатойтранскобаламином 11 крови кролика.С этой целью, целлофановый мешок с сывороткой крови помещают в 7,5 М раствор гуанидин-НС 1 (в соотношении1:15) и выдерживают при комнатной:температуре в течение 72 ч, По окончании процесса насыщения гуаиидиномсыворотку подвергают диалиэу в течение 24 ч против 0,05 М калий-фосфатного буфера (рН 7,5) при 4 С и замораживают,Перед опытом приготовленную такимобразом сыворотку размораживают инасыщают Со СИСЬКА из расчета0,025 мкг на 1 мл, клетки суспендируют в среде 199 (не содержащей витамин В,2 ) и помещают в пробирку (сусбпендирование в расчете 22,7 10 клеток на 1 мл среды), добавляют 0,5 млстандартной сыворотки, инкубируютО15 мин при 37 С, вносят 4 мл охлажденной до 0 С среды 199 и центрифуогируют 10 мин при 4 С при 500 д. Дляосвобождения от иесвязавшейся радиоактивности кпетки ресуспендиоуют в4 мл среды 199 и центрифугируют притех же условиях. 5 0 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Осадок клеток вновь суспендируютв 0,5 мл среды 199, добавляют 0,5 мл раствора реополиглюкина, содержащего 12,1 мг/мл цистеина и 34,0 ед/мл папаина, инкубируют в течение 5 минопри 37 С. Реакцию останавливают добавлением 4 мл охлажденной до 0 С среды 199, Пробы центрифугируют в тех же .условиях. Осадок содержит клетки; освобожденные от рецепторов, супернатант - рецепторы с транскобаламин-кобаламиновым комплексом, меченным по Со . Радиоактивность измеряют на-счетчике. Количество рецепторов и кобаламина рассчитывают с учетом того, что одна молекула транскобаламина связывает одну молекулу кобаламина, в свою очередь один рецептор клетки связывает один транскобаламин-кобаламиновый комплекс.Уровень неспецифической сорбции радиоактивного комплекса определяют путем предварительной инкубации клеток с сывороткой, насыщенной немече - ным кобаламином и повторным инкубированием клеток со стандартной сывороткой, содержащей транскобаламин- -11+СО СИСЫ комплекс.В данном примере радиоактивность супернатанта (рецепторы) - Р - составила 1400 расп./мин; осадка (клетки) - К - 1020 расп./мин; супернатанта при неспецифической сорбции (Ро ) 15 расп./мин; радиоактивность 10 мкл препарата Со СИСЫ, содержащегос454О г кобаламина, составила 125000 расп./мин, т.е. удельная радиоактивность кобаламина (Д) равна 125 й Ф-10 =2 7 10 распадов на 1 г 454кобаламина.В данном примере в пробу взято 22,7 фО клеток (Б). Отсюда можно рассчитать количество кобаламина, связавшегося с одной клеткой: Р-Р-я- =2 22.10 г количество кобал- Д, 11 йамина, поступившего в клетку эаК "915 мин =1 63 10 г количестводиФрецепторов на одну клетку (учитывая, чтограммолекула Со СЯСЬ содер 97жит 6,02 10 молекул, а мол. вес23цианкобаламина равен 1358) - 98 ре-. цепторов.Таким образом, изобретение позволяет определить состояние рецептор- ного аппарата клеток эа счет количе1381400 Составитель А. АгуреевРедактор Н. Швыдкая Техред М.Дидик Корректор,О. Куидрик Заказ 81/40 .,Тираж 847 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб.,д. 4/5Производственно-полиграФическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 ственного определения рецепторов ктранскобаламин-кобаламиновому комплексу при одновременном расчете суммарного количества кобаламина, поступившего в клетку за определенныйпромежуток времени. формула изобретения10 Способ определения состояния рецепторного аппарата клеток, включающий суспендирование клеток в среде Игла или 199, инкубацию с сывороткой, содержащей транскобаламин-кобал аминовый комплекс, меченый по Со,отмывание путем суспендирования ицентрифугирования с последующим ре-суспендированием в той же среде, добавлением к смеси реополиглюкинав объемном соотношении 1:(0,8-1,3),содержащего 34 ед,/мл паланка ицистеин повторной инкубацией, центрифугированием смеси, определениемуровня радиоактивности в супернатанте и осадке, по которой соответственно рассчитывают количество рецепторов и количество кобаламина, поступившего в клетку, при этом о состоянии аппарата судят по значению измеренных параметров.