Способ определения качества спермиев

(19) (31 297 ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ькир) нии (,н - ии);. ГОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТ СССР ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИ1329780 Интенсивность свечения поврежденных спермиев, баллы Концент рация этидиум бромидамас.Е Концентрация тиазинового красного, мас,Е,002 0,003 0,005 0,006 0,008 0,010 0,012 001 0 0,015 0,02 0003 2 3 0,000 0,000 008 3 0,0 0,00 0020 0,0020,003 Изобретение относится к биологии размножения животны и предназначено для лабораторных и клинических исследований в области криобиологии, ветеринарии и ме. дицины. Целью изобретения является повышение точности определения.Пример. В питательную среду вводят тиазиновый красный и этидиум бромид в количестве 0,006 и 0,001 мас.%: соответствено. Затем отмеривают в пробирку в соотношении 1:О сперму и питательную среду, содержагцук) флуорохром (например 0,01 мл спермы и 0,1 мл среды, тщательно переме. шивают, наносят на предметное стекло каплю смеси и плотно накрывают покровным стеклом так, чтобы движение спермиев было ограничено. После этого препарат помещают под люминесцентный микроскоп (МЛили МЛ) . При этом используют возбуждающий свет с длиной волны 365 нм, а флуоресценцик наблюдают в области 500 700 нм. Препарат рассматривакт под иммерсией при увеличении не менее 90 Х 15 в отраженном свете. В поле зрения учитывают число (процент) поврежденных и нормальных спермиев. Г 1 ри этом на темно-синем фоне четко просматриваются более светлые спермии, которые относят к нормальным (акросома нормальных спермиев несколько темнее головки, но светлее фона). При повреждении акросомы, когда нарушена проницаемость ее мембраны, тиазиновый красный, проникая внхтрь акросомы, вызывает ее светло-салатное свечение. При более глубоком повреждении акросомьь сопровождающемся нарушением ее морфологического строения, чаще всего приобретением шаровидной формы, тиазиновый красный вызывает ее интенсивное ярко-малиновое свече ние. Гри повреждениях цитоплазматической мембраны сперм иев этидиум бром ид проникает в клетку и, связываясь с ДНК, вызывает ярко-малиновое свечение головки спермия.Оптимальное соотношение в смеси тиазинового красного и этидиум бромида определяк)т следующим образом. В питательную среду (разбавитель спермы петухов ЛКС) вводят различные навески красителей, а также детергент дигитанин в конечной кон центрациимМ с целью повреждения увсех спермиев мембран головок и акросомРезультаты исследований представленыв таблице.Для удобства учета интенсивности свечения поврежденных органелл спермиев при применении той или иной концентрации красителей в таблице приведена характеристика по 5-балльной шкале, где 5 баллов отражают наиболее интенсивное свечение по врежденных акросомы и головки спермия;25 4 балла - интенсивное свечение одной поврежденной органеллы (например акросомы) и менее интенсивное, но еще четко различимое свечение другой (например головки); 3 балла - недостаточно интенсивное свечение головки и акросомы или же достаточно интенсивное свечение одной органеллы при еле различимом свечении другой;2 балла -- слабое свечение головки и акросомы; 1 балл - еле различимое свечение спермиев.1329780 формула изобретения Составитель Л. ФилипповаРедактор И, Рыбченко Техред И. Верес Корректор М. 1 ПарошиЗаказ 35118 Тираж 595 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССР по делич изобретений и открытий113035, Москва, Ж 35. Раушская наб, д. 4,5Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проек 1 ная. 4 Представленные в таблице данные сви детельствуют о том, что тиазоновый красный и этидиум бромид можно эффективно использовать в смеси в довольно широких пределах (0,003 - 0,012 м ас.% и 0,0005 - 0,002 мас.% соответственно). При этом оптимальная концентрация тиазинового красного в данной смеси составляет 0,005 - 0,008 мас.%, а этидиум бромида - 0,0008 - 0,0015 мас.%. Недостаточная концентра. ция красителей (или одного из них) в сме. си, т.е. меньше нижнего предела, не обеспечивает четкой дифференциации структур спермия в связи со слабым свечением, а избыток (выше верхнего предела) приводит к увеличению интенсивности фонового свечения, что затрудняет наблюдение. Избыток одного красителя (например тиазинового красного ) маскирует люминесценцию другого (этидиум бром ида), введенного в недостаточной концентрации. Таким образом, предлагаемый способ позволяет при необходимости дифференцировать в препарате спермии на нормальные (несветящиеся темно-синяя головка и акросома); с нормальной головкой (несветящаяся, темно-синяя) и поврежденной акросомой (светло-салатное или ярко-малиновое свечение); с поврежденной головкой (ярко- малиновое свечение) и неповрежденной акросомой (несветящаяся, темно-синяя); с поврежденной головкой и поврежденной акросомой (светящаяся светло-салатная акросома и ярко-малиновая головка или же ярко-малиновое свечение акросомы и головки); с нормальной головкой (несветящаяся, темно-синяя) и отсутствием акросомы; с поврежденной головкой (ярко-малиновое свечение) и отсутствием акросомьц 5 отдельно расположенные друг от друга светящиеся органеллы спермия (акросома, головка, хвостик).Данная дифференциация спермиев даетвозможность более точно установить, а затем и устранить причину тех или иных повреждений. Это особенно важно при разработке режимов замораживания и оттаивания спермы, изучения токсичности криопротекторов, разработке сред для хранения и замораживания спермы, режимов эксплуатации самцов, в клинической практике и т.д. Способ определения качества спермиев, включающий смешивание спермы с питательной средой, в которую вводят флуорохром этидиум бромид, и последующий анализ окрашенных спермиев под микроскопом, отличающийся тем, что, с целью повышения точности, в питательную среду дополнительно вводят флуорохром тиазиновый красный при следующем соотношении ингредиентов, мас.%:Флуорохром тиазиновыйкрасный 0,003 - 0,012 Флуорохром этидиум бромид 0,0005 - 0,002 Питательная среда Остальное а о качестве спермиев судят по повреждению их головки и акросомы.