Способ хранения спермы осетровых рыб

) ,Щ) А и А 01 К 61/О ГОСУДАРСПО ДЕЛ РЕТ СТВ иванияздух соамеры в0,5 0,005 -0,10,001 -0,01Остальное ВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИ ОПИСАНИЕ ИЗК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛ(71) Институт проблем криобиологиии криомедицины АН Украинской ССР.(56) 1. Персов Г.М, Некоторые данные по выживаемости спермиев севрюги (Ас 1 репвег вСе 11 ацз 1,). ДАН ССС1941, 33, 9 4, с.327-329.2. Черфас Б.Л, Рыбоводство вестественных водоемах. М., Пищепром издат, 1956, с.114-115.(54)(57) 1. СПОСОБ ХРАНЕНИЯ СПЕРМЫ ОСЕ 1 РОВЬИ РЫБ, предусматривающий разлив спермы в сосуды и, выдерживание ее в термостате при температу- ре 1-10 фС, отличающий,с я ,тем, что, с целью сохранения оплодо творяющей способности спермы, пос,леднюю разбавляют защитным раствором в соотношении 1;1, полученную смесь разливают в сосуды слоем 2-10 мм, а в процессе выдерж через термостат продувают во скоростью 0,004-0,4 объема к 1 ч.2, Способ по п,1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что защитный раствор содержит воду, трис-цитратный буфер рН 7,9.-8,2, моногидрофосфат натрия,.глюкозу, бычий сывороточный альбумин, стрептомицина сульфат и гидрокарбонат натрия при следующем соотношении компонентов, мас.В:Трис-цитратныйбуФер рН 7,9-8,2 0,15-6,5Моногидрофосфатнатрия -3,0Гидрокарбонатнатрия О,3 -г,ОГлюкоза 0,3 -3,6Бычий сывороточный альбуминСтрептомицинасульфатВодаИзобретение относится к рыбоводству и может быть использовано для искусственного разведения осетровых рыб (белуги, севрюги, стерляди, осетра и др.).5Известен способ хранения спермы осетровых рыб, при котором сперму хранят на льду при температуре 1-3 С Ц.Однако данный способ позволяет сохранить сперму незначительное вре мя, при этом ее оплодотворяющая способность снижается с первых суток хранения.Наиболее близким к изобретению является способ хранения спермы осетровых рыб, предусматривающий разлив спермы в сосуды и выдерживание ее в термостате при 1-100 С(2) .Однако известный способ не обес печивает сохранение оплодотворяющей способности спермы.Цель изобретения - сохранение оплодотворяющей способности спермы.Поставленная цель достигается 25 тем, что согласно способухранения спермы осетровых рыб, предусматривающему разлив спермы в сосуды и выдерживание ее в термостате при температуре 1-10 С, сперму разбавляют защитным раствОром в соотношении 1;1, полученную смесь разливают в сосуды слоем 2-10 мм, а в процессе выдерживания через термостат пРодувают воздух со скоростью 0,004-0,4 объема камеры в 1 ч. 0,3-2,0 0,3-3,6 Кроме того, целесообразно включить в защитный раствор воду, трис.цитратный буфер РН 7,9-8,2, моногидрофосфат натрия, глюкозу, бычий 40 сывороточный альбумин, стрептомицина сульфат и гидрокарбонат натрия при следующем соотношении компонентов, мас.%Трис цитратный 45буфер РН . 7,9-8,2 0,15-6,.5Моногидрофосфатнатрия 0,5-3,.0ГидрокарбонатнатрияГлюкозаБычий сывороточныйальбумин 0,005-0,1СтрептомицинасульФат 0,001-0,01Вода Остальное 55Способ осуществляется следующим образом.Сперму охлаждают до 1-10 С со скоростью 4-6 /мин и смешивают 1;1 с защитным раствором, имеющим такую же 60 температуру. Раствор готовят на речной воде. Сперму, смешанную с растВором, разливают в плоские сосудЫ слоем 2-10 мм и устанавлив 0 ают в термостат с температурой 1"10 С. Тер- ,у0,3-2,0 0,3-3,6 Широкий предел расхода воздуха при продувке объясняется универсальностью способа, предусматривающего как очень плотную загрузку сосудами со спермой (в этом случае необходима продувка до 0,4 объема камеры в 1 ч) так и минимальную загрузку, напри" мер 1 сосуд (чашка Петри) на 200- литровый термостат (при этом вполне достаточна продувка 0,004 объема камеры в 1 ч).Воздух, используемый для продувки через термостат, должен содержать кислород не ниже нормального атмосферного уровня, температура его должна быть снижена до температуры мостат продувают воздухомсо скоростью 0,004-0,4 объема камеры в 1 ч.Для смешивания спермы берут защитный раствор при следующем соотношении компонентов, мас. ЪТрис-цитратныйбуфер РН 7,9-8,2 0,15-6,5Моногидрофосфат натрия 0,5-3,0ГидрокарбонатнатрияГлюкозаБычий сывороточ-ный альбумин 0,005-0,1Стрептомицинасульфат 0,001-0,01Вода ОстальноеСмешивание спермы с защитным раствором производят в соотношении 1;1, которое выбрано потому, что при изменении соотношения в сторону увеличения содержания спермы концентрация защитных добавок, входящих в раствор, становится недостаточной для сохранения оплодотворяющей способности спермы, а увеличение концентрации) добавок в сайом защитном растворе изменяет его осмотичность и тем самым делает его непригодным для использования.Увеличение разбавления спермы защитным раствором приводит к неоправданному увеличению расхода реактивов и габаритов сосудов для хранения спермы, причем сохранность спермы при этом не повышается.В процессе хранения спермы через термостат продувают воздух, что необходимо для обеспечения нормального дыхания спермы в процессе ее хранения.При недостаточной продувкев сперме из-за накопления углекислоты происходит закисление спермиев и даже их гибель.При излишне интенсивной продувке наряду с подсыханием спермы возникае 1 опасность развития губительных для клеток спермы процессов перекисного окисления.150 П р и м е р 2. 30 смф спермы осетра (Ас 1 репзег д 01 йепз 1 ИЖ 1 ВгапЮ 1 с активностью 75 смешивают с 30 см раствора, содержащего, : трис-цит-. хранения, а его относительная влаж- ность пос.е охлаждения должна быть не ниже 70.Высота слоя спермы в сосуде 2- 10 мм обусловлена необходимостью нормального газообмена и может колебаться для разных видов осетровых рыб.Так, например, для спермы белуги и севрюги наилучшие результаты получаются при высоте слоя 5 мм, а10 для осетровых русского и персидского видов высота слоя 10 мм еще не сказывается значительно на результатах хранения.Высота слоя 10 мм является граничной для всех видов осетровых .рыб, и увеличение ее приводит к развитию значительной гипоксии при хранении ( независимо от интндивности про-, дувки термостата). . 20При снижении высоты слоя спермы ниже 2 мм к сперматозоидам поступает повышенное количество кислорода и развиваетсягипероксия, при этом происходит защелачивание спермы (двиг. 0,5-0,6 рН) за счет активизации внутриклеточного окисления, что приводит к гибели сперматозоидов, и создаются условия для развития перекисного окисления липидов в сперме, что также небезопасно для нее.Кроме того, сперма при хранении разделяется на два слон: слой осевших на дно клеток и плазму. Если влажностный режим во время хранения несколько смещается, плазма либо испаряется, либо обводняется, происходит изменение ее осмотического давления, которое при значительном смещении может вызвать гибель клеток. 40 Однако при высоте слоя 2 мм изменение осмотического давления не явля.ется губительным, так как слой клеток остается защищенным слоем плазмы.П р и м е р 1, 50 см спермы белу3ги ( Никло Ьояо Ь ) с активностью 80 смешивают с 50 см 3 раствора, содержащего, : тряс-цитратного буфера рН 7,9 0,15; моногидрофосфата натрия 0,50 у гидрокарбоната натрия 0,3; глюкозы 0,3; бычьего сывороточного альбумина 0,0050; стрептомицина сульфата 0,001 и остальное речная вода. После перемешивания смесь разливают в сосуды слоем 2 мм и помещают в термостат с температурой 1 С, через который продуваютовоздух со скоростью 0,004 объема камеры термостата в 1 ч. Через 5 сут хранения активность спермы 60, опло дотворяющая способность 70. 40 ратного буфера рН 8,2 6,5; моногидрофосфата натрия 3; гидрокарбоната натрия 2; глюкозы 3,6; бычьего сывороточного альбумина 0,1; стрептомицина сульфата 0,001 и остальное речная вода. Смесь разливают в сосуды слоем 10 мм и помещают в термостат с температурой 10 С. В процессе хранения производят продувку камеры термостата воздухом со скоростью 0,4 объема камеры в 1 ч. Через 5 сут активность спермы 65, оплодотворяющая способность 72.П р и м е р 3. Сперму севрюги (Ас 1 репяег я 1 е 11 аця Ра 11 ая) с активностью 90 в количестве 100 см смешивают. с 100 см раствора, содержащего, : трис-цитратного буфера рН 8,0 0,75; моногидрофосфата натрия 1; гидрокарбоната натрия 1,5; глюкозы 1,8; бычьего сывороточного альбу- мина 0,01; стрептомицина сульфата 0,005 и остальное-речная вода. Смесь разливают в сосуды слоем 5 мми по- мещают в термостат с температурой 4 С, через который продувают воздух со скоростью 0,1 объема камеры термостата в 1 ч.Через 5 сут хранения активность спермы 75-80, оплодотворяющая способность 92.П р и м е р 4. Сперму белуги (Нцяо Ьцяо Ц с активностью 80 в количестве 30 см смешивают с 30 см раствора, содержащего, : трис-цитратного буфера рН 8,0 0,3; моногидрофосфата натрия 1; гидрокарбоната натрия 1; глюкозы 2; бычьего сывороточного альбумина 0,01; стрептомицина сульфЪта 0,01 и остальное речная вода. Смесь разливают в сосуды слоем 1 мм, помещают в термостат с температурой 5 С и продувают воздухом со скоростью 0,05 объема камеры в 1 ч.Через 72 ч хранения наступает гибель спермы в результате частичного высыхания смеси.П р и м е р 5. 70 см спермыосетра (Ас 1 репяег ац 1 йепзЫЖ 1 Вгапй) с активностью 90 смешивают с 70 см раствора, содержащего, : трис-цитратного буфера с рН 8,0 2; моногидрофосфата натрия 0,8; гидрокарбоната натрия 1,5; Глюкозы 0,5; бычьего сывороточного альбумина 0,05; стрептомицииа сульфата 0,01 и остальное - речная вода. Смесь разливают в сосуды слоем 3 мм и помещают в термостат при температуре 15 С с интенсивностью продувоки воздухом 0,1 объема камеры в 1 ч.Через 40 ч отмечается гибель клеток спермы.П р и м е р 6. Сперму севрюги (Ас 1 репзег, зйе 11 аСцз Ра 11 аз) с а- тивностью 80 в количестве 50 см1127554 ВНИИПИ Заказ 8773/2 Тираж 721 ПодписноеЮМЮюЮафаф юаЮМФилиал ППП фПатентф, г.Ужгород, ул,Проектная, 4,смешивают с 50 см раствора, содержащего, : трио-цитратного буферарН 8,0 5; моногидрофосфата натрия1,2; глюкозы 3; бычьего сывороточного альбумина 0,01; стрептомицинасульфата 0,01 и остальное - речнаявода, Смесь разливают,слоем 13 мми помещают в термостат при,температуре 7 С. Термостат йродуваетсявоэдухбм со скоростью 0;01 обьемакамеры в 1 ч. Через 100 ч спермапогибает от недостатка кислородана дне сосуда под слоем плазмы.П р и м е р 7. 100 см спермыбелуги (Нцяо Ьцяо 1 ) с активностью90 смешивают с 100 см раствора, 15имеющего в своем составе, : трисцитратного буфера рН 8,0 0,3; моногидрофосфата натрия 1; гидрокарбо. ната натрия 1; глюкозы 2; бычьегосывороточного альбумина 0,1; стрептомицина сульфата 0,01 и остальноеречная вода. Смесь разливают в сосуды слоем 5 мм и помещают в термосотат с температурой 5 С, которыйпродувается воздухом со скоростью 250,002 объема камеры в 1 ч. Через5 сут активность спермы 20-25,оплодотворяющая способность. 22.Снижение рыбоводных качеств вызванотеми же причинами, что и в примере б.П р и м е р 8. Сперму севрюги(Ас 1 репяег яСе 11 а 1 ця Ра 11 ая) сактивностью 75 в количестве 50 смсмешивают с 50 см раствора, содер 3жащего,трис-цитратного буферарН 8,0 5; моногидрофосфата натрия2,5 гидрокарбоната натрия 0,7;глюкозы 0,2; бычьего сывороточногоальбумина 0,01 р стрептомицийа сульфата 0,01 и остальное - речная вода.,Смесь, разлитую в сосуды слоем 4 мм,помещают в термостат. Температурахранения З-С, скорость продувки возодухом 0,07 объема камеры в 1 ч. Через5 сут активность спермысоставляет 4540-45 оплодотворяющая способность47. Ухудшение рыбоводных качестввызвано недостатком глюкозы.П р и м е р 9. 50 см спермыосетра (Ас 1 репяег дц 1 депяадЫ 50ВгапЖ) с активностьк 80 смешиваютс 50 см раствора, имеющего в соста-:.ве, ; трис-цитратного буфера рН8,0 0,051 моногидрофосфата натрия 3;гидрокарбоната натрия 2; глюкозы 55З,б бычьего сывороточного альбумина0,11 стрептомицина сульфата 0,01 . и остальное - речная вода. Смесьразливают в сосуды слоем 4 мм и помещают в термостат с температурой16 фс, продувая воздух со скоростью0,4 объема камеры в 1 ч. Через 5 сутактивность спермы 25, оплодотворяю- .щая способность 17 Ъ. Низкие рыбоводные качества объясняются защелачи.ванием спермы при хранении вследствиенедостаточной буферной емкости защит-.ного раствора.Пр и м е р 10. Сперму севрюги(Ас 1 репяег яСе 11 а 1 ця Ра 11 ая) с активностью 90 в количестве 100 смсмешивают с 100 см раствора, включающего, Ъ: трис-цитратного буферарН 7,5 0,15; моногидрофосфата натрия 0,5; гидрокарбоната натрия 0,3;глюкозы 0,3; бычьего сывороточногоальбумина 0,005;стрептомицина сульфата 0001 и остальное - речная во-да. Смесь разливают в сосуды слоемЗ.мм и помещают в термостат с температурой 2 С, который продувается,4воздухом со скоростью 0,1 объемакамеры в 1 чЧерез 5 сут отмеченаединичная активность спермиев, оплодотворяющая способность отсутствует.Ввиду низкого рН (7.,5) защитногораствора сперма частично активирована и теряет свои рыбоводные качества.П р и м е р 11. 100 см спермыбелуги (Ацяо пцяо 1), имеющей активность 80, смешивают с 1.00 см раствора, содержащего, Ъ: трис-цитрат-ного буфера 0,3; моногидрофосфатанатрия 1; гидрокарбоната натрия 11глюкозы 2; .бычьего сывороточногоальбумина 0,1; стрептомицина сульфата 0,0001 и остальное - речная вода.Смесь разливают в сосуды слоем 5 мм .и помещают в термостат, где поддержи"вается температура 9 С и произвоодится продувка воздухом со скоростью0,006 объема камеры в ч. Через 100 чсперма погибает в результате раз-вития микрофлоры.Предлагаемый способ позволяетудлинить переживаемость спермы до5 дн с сохранением ее оплодотворяющей способности почти до 1 ООЪ.Этодает воэможность транспортироватьсперму с одного рыборазводногопредприятия на другое, обеспечитьритмичность работы этих предприятий,сократить количество производителейпутем более полного использованиясперМы,1