Способ количественного определения радиоактивных метаболитов стероидов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 19) (11 1590 1)4 С 01 И 33/50 Н инск ЕЛЕ- РОИГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИИ ПИСАНИЕ ИЗ А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Центральная научно-исследовательская лаборатория Четвертого глав"ного управления при Министерствездравоохранения СССР(54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДНИЯ РАДИОАКТИВНЫХ МЕТАБОЛИТОВ СТЕДОВ(57) Изобретение относится к химиии биохимии природных соединений, предназначено для количественного определения радиоактивных органических соединений, в частности стероидных гормонов. Цель изобретения - повышениеточности и ускорение способа. Дляэтого получают гомогенат аденомыпредстательной. железы человека в0,05 ммоль л-" фосфатном буфере, рН7,4,Н 3 5 с -дигидротестостеронпри концентрации 100 наномолей.л инкубируют с гомогенатом аденомы предстательной железы в присутствии Ь- глюкозы, глюкозо-б-фосфатаНАДфН и глюкозо-фосфатдегидрогеназы в течение 30-90 мин при 37 С. Общий объем пробы 75-100 мкл, К пробам добавляют 25-50 мкл 1 н.НС 1, стероиды ; 5 с-андростан-ЗЫ,17 р-диол, 5 с -андростана, 17-диол, 5-днгидротестостерон и лиофилизуют. К остатку добавляют 50- 100 мкл смеси бензолметанол (1:1) и хроматографируют пробы в системе растворителей бензол;ацетон: этиловый спирт (9:1:0,5). Пластинки высушивают, опрыскивают. проявляющей смесью: ледяная уксусная кислота - концентриО рованная серная кислота - анисовый э альдегид - метанол (25:1:3:71), нагревают 5-7 мин до 100-110 С. Соответствующие нужным метаболитам зоны вырезают вместе с алюминиевой подложкой, помещают в сцинтилляционный флакон, заливают сцинтилляционной смесью, радиометрию идентифицированных Выев зон ведут, помещая в сцинтилляцион- (ф ную жидкость слой силикагеля с алюми- фы ниевой подложкой. Сл1. 13Изобретение относится к химии ибиохимии природных соединений и может быть использовано для количественного определения радиоактивных органических соединений, в частностистероидных гормонов,Целью изобретения является повышение точности и ускорения способаза счет получения сухого остатка радиоактивных стероидов исходной смесии радиометрии идентифицированныхзон в присутствии слоя силикагеляи алюминиевой подложки.Способ осуществляется следующимобразом.Получают гомогенат аденомы предстательной железы человека в0,05 моль л-" Фосфатном буфере рН 74Н 1 5 Ы-дигидротестостерон при концентрации 100 нмоль л-" инкубируютс гомогенатом аденомы предстательнойжелезы в присутствии Э-глюкозы, глюкозо-б-фосфата, НАД- Н и глюкозо-Фосфатдегидрогеназы в течение 3090 мин при 37 С. Общий объем пробы75 - 100 мкл. К пробам добавляют 25 -50 мкл 1 н НС 1, намеченые стероиды:5 Ы-андростан-ЗЫ, 17 р-диол, 5 Ы-андростан-Зр, 17 р-диол, 5 Ы-дигидротесто-стерон и лиофилизируют. К остаткудобавляют 50-100 мкл смеси бензолметанол (1:1 по объему) и для хроматографии используют точный объем полученного раствора (обычно 40-90 мкл).Пробы хроматографируют в системерастворителей бензол:ацетон;этиловыйспирт (9: 1;0,5). Пластинки высушива-ют, опрыскивают проявляющей смесью:ледяная уксусная кислота - конц, серная кислота - анисовый альдегид-метанол (25;1;3:71), нагревают от 5 до7 мин при 100-110 С, соответствующиенужным метаболитам зоны вырезаютвместе с алюминиевой подложкой и слоем силикагеля, помещают в сцинтилляционные флаконы, заливают сцинтилляционной смесью и радиометрируют наспектрометре модели 8100 "ЛКБ" Швеция) или модели СЛ("Интертекник",Франция), Абсолютные количества радиоактивных метаболитов подсчитывают,учитывая коэффициент эффективностисчетчика.11 р и м е р 1. Вариант 1, На вырезанные пластинки со слоем силикагеля разной площади в пределах 0,53,0 см наносят одинаковое количество радиоактивных ф С 1 гептадеканаилиН гептадекана. Такое же коли 15903 2 чество радиоактивных соединений вносят в пустые сцинтилляционные флаконы. Во все флаконы добавляют одинаковый объем сцинтилляционной смеси, инкубируют при нормальных условиях личество "фС андростен-3,17.-дионаилиН тестостерона и такое.же количество радиоактивных нуклидов вносят в сцинтилляционные флаконы. Половину пластинок опрыскивают проявляющей смесью и проявляют при нагревании, Все пластинки помещают в сцинтилляционные Флаконы, во все флаконызаливают сцинтилляционную жидкость ирадиометрируют, Показано, что использование проявляющей смеси для детектирования стероидов вызывает химическое гашение при радиометрии толькоН соединений,Положительный эффект предложения,Предложенный способ практическиустраняет потери радиоактивных веществ при анализе, выход радиоактивных стероидов после хроматографии1007, а по известному способу 75 -857,. 40 45 50 55 3,5-4,0 ч и радиометрируют. Показано, что плошадь вырезаемой зоныпластинки со слоем силикагеля на алюминиевой подложке мало влияет на коли-10 чественное определение радионуклидов,Вариант 2. На пластинки одинаковой площади (около 2 см 2) и одинаковой толщины слоя силикагеля наносятувеличивающиеся количества 4 С про 15 гестерона илиН тестостерона и3проводят радиометрию, как в варианте1 данного примера. Показано, что присутствие пластинок не влияет на ради,ометрию пропорционально увеличивающе 20 гося количества радионуклидов, меченых Рф С 3 или Н.Вариант 3, Разные количества смеси ЗН тестостерона или Н 5 с-дигидротестостерона вместе с нерадиоактивными (по 10 мкг - 15 мкм каждого) наносят на пластинку "Силуфол 1",хроматографируют в системе растворителей, как указано выше в общем случае, Положение стероидов (пятна илиЗ 0 зоны) определяют в парах йода, пятнавырезают и радиометрируют как в варианте 1 данного примера, Показано, чтопосле хроматографирования сохраняетсяпропорциональность в количестве опре 35 деляемых радионуклидов,П р и м е р 2. На пластинки одинаковой площади (около 2 см) и одинаковой толщины йаносят одинаковое ко13159 Формула изобретения Составитель Л, АртюшинаРедактор Г, Гербер Техред Л.Олийнык Корректор Т, Колб Заказ 2355/47 Тираж 776 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб д, 4/5Производственно-полиграфическое предприятие,г. Ужгород, ул, Проектная, 4 В предлагаемом способе в одной пробирке проводятся следующие операции: 1) инкубация водных гомогенатов с радиоактивным соединением; 2) лиофилизация водных растворов радиоактивных соединений; 3) растворение (не экстракция) лиофилизированных радиоактивных веществ в точном объеме органического растворителя; 4) нанесение на хроматографическую пластин ку точного объема раствора радиоактивных соединений, хроматография и идентификация радиоактивных соединений; 5) вырезание зон (пятен) и радиометрия. 15 В предлагаемом способе достигнуто повышение точности, так как вообще отсутствуют потери радиоактивных веществ, В известных методах всегда 20 имеют место потери радиоактивных соединений и их учет проводят, добавляя дополнительно радиоактивные вещества аналогичной структуры, содержаниеС, как указывалось выше. 25Следовательно, предлагаемый способ не только повышает точность анализа Оз 4радиоактивных соединений, сокращаетвремя анализа (включает 5 стадийвместо 7), но и имеет значительныйэкономический эффект: в сотни разуменьшается количество (объем) органических растворителей, необходимыхдля анализа, и отпадает необходимостьдополнительного применения радиоактивных веществ, меченых "С,Способ количественного определения радиоактивных метаболитов стероидов путем инкубации ткани с радиоактивным предшественником, получениясухого остатка радиоактивных стероидов, растворения сухого остатка,хроматографирования и радиометрии,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, сцелью повышения точности и ускоренияспособа, сухой остаток получают лиофилизацией исходной смеси, а радиометрию идентифицированных зон осуществляют, помещая в сцинтилляционнуюжидкость слой силикагеля с алюминиевой подложкой,