Способ окраски нервной ткани на гистологическом препарате

(21) (22) ( 46) (71) тут СССР ий инстины АМНия подверм микроиссл ости от з в гают резке на томе либо упл целлоидине. С мораживаю тняю парафине или анивают толуезы док и иссл етооптивым синим идч к СУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ 3536152/28-1210,01,8330.11.86. Бюл. 1 Ф 44Научно-исследовательскспериментальной меди(54) СПОСОБ ОКРАСКИ НЕРВНОЙ ТКАНИ НАГИСТОЛОГИЧЕСКОМ ПРЕПАРАТЕ(57) Изобретение относится к областимедицины, а именно к гистохимии, может быть применено при гистологическом исследовании срезов биологических тканей, содержащих миелиновыеволокна, Цель изобретения - прокравание клеточных элементов в дем линизированнои ткани за счет экспонирования биологического материалав растворе бихромата калия в разработанных временных интервалах. Кусочки нервной ткани размером 2,53,5 мм фиксируют в 1 ОХ-ном раствореФормалина 12-48 ч, затем экспонируют45-50 ч в 3%-ном растворе бихроматакалия. Кусочки споласкивают в нескольких порциях бихромата калия ипомещают на 24-48 ч в 1 Х-ный растворосмиевой кислоты на 37.-ном растворебихромата калия. Затем образцы промывают в течение 12-24 ч в водопроводной воде, Далее материал в зави 1 12Изобретение относится к медицине,а именно к гистохимии, и может найтиприменение при гистологическом исследовании срезов биологических тканей,содержащих миелиновые волокна.Целью изобретения является прокрашивание клеточных элементов в демиелинизированной нервной ткани путем экспонирования биологическогоматериала в растворе бихромата калия, в растворе осмиевой кислоты набихромате калия в разработанных вре.менных интервалах.Способ осуществляют следующим образом.Кусочки нервной ткани размером2,5-3,5 мм Фиксируют в 10%-ном растворе формалина в течение 12-48 ч изатем экспонируют в течение 45-50 чв 3%-ном растворе бихромата калия.Кусочки споласкивают в несколькихпорциях бихромата калия и помещаютна 24-48 ч в 1%-ный раствор осмиевойкислоты на 3%-ном растворе бихроматакалиявЗатем .образцы промывают в течение12-24 ч в проточной водопроводнойводе.Далее материал в зависимости отзадач исследования либо подвергаютрезке на замораживающем микротоме,либо уплотняют в парафине или целлоидине, Полученные срезы докрашиваюттолуидиновым синим и исследуют светооптически.П р и м е р 1. Образцы нервнойткани от животных с демиелинизирую"щим заболеванием нервной системы разрезают на кусочки толщиной 3,5 мм,помещают на плотную бумагу с отверстиями (наподобие перФокарты) и опускают в 10%-ный формалин на 24 ч,Экспонируют в течение 45 ч в 3%,ном растворе бихромата калия с ежедневной сменой раствора,Снимают кусочки с плотной бумагии помещают в 1%-ный раствор осмиевойкислоты на 3%-ном растворе бихроматакалия на 24 ч в плотно закрытые банки, обернутые темной бумагой. Раствор осмиевой кислоты сливают, образцы помещают в марлю, завязывают ипромывают в проточной водопроводнойводе в течение 12 ч, Затем материалпомещают на 15 мин в дистиллированную воду и подвергают резке на замораживающем микротоме. Толщина получаемых срезов 10-15 мкм, а при резке на криокате - 3,5-5 мкм, 73769 20 П р и м е р 2, Кусочки нервнойткани размером 2,5 мм обрабатываютаналогично примеру 1, но время экспозиции в растворе бихромата калия47 ч, а в растворе осмиевой кисло ты - 35 .ч. После этого материал обезвоживают этиловым спиртом восходящей крепости (70, 80, 90, 96, 100 ).Время экспозиции в каждом спирте1 сут. Затем материал помещают. (не 30 35 51015 Полученные срезы докрашивают на предметном стекле толуидиновым синим, дифференцируют в 96 -ном спирте, просветляют в эвкалиптовом масле, промывают в ксилоле и заключают в бальзам.Полученные препараты исследуют под микроскопом при максимальных увеличениях с использованием иммерсии. На препаратах видны ярко-синие ядра гематогенных макрофагов с бледно-голубой цитоплазмой, нейтрофильные гранулоциты, лимфоциты, глиальные клетки среди Фрагментов дезинтегрированного миелина в виде отчетливо- прослеживаемого черного цвета осмиофильной зернистости. В отдельных клетках хорошо виден Фагоцитоз продуктов распада миелина. менее 2 сут) в смесь, состоящую из 40 мг сухого целлоидина, растворенного в 100 мл абсолютного спирта, 100 мл эфира и 200 г касторового масла.Экспонирование по 45 мин в трех порциях хлороформа. Далее образцы выдерживают в течение не более 12 ч в смеси равных частей парафина ио хлороформа и экспонируют при 56 С в термостате по 1,5 ч в двух порциях парафина с последующей заливкойв парафин,Парафиновые срезы депарафинируюти докрашивают толуидиновым синим.На препаратах видны клеточные элементы (гематогенные и глиальные),среди которых локализуются продуктыраспада миелина. П р и м е р 3, Кусочки нервной ткани размером 3,5 мм после Фиксации и экспонирования в бихромате калия в течение 50 ч, в осмиевой кислоте в течение 48 ч и промывки в проточной водопроводной воде подвергают обезвоживанию в спиртах восходящей крепости: в 70 -ном 1 ч, в 96 -номо ь 2 ч, в абсолютном спирте 2,5 ч, в спирт-эфире 1,5 ч. После этого матеФормула изобретения Составитель М, ПознякТехред Л.Сердюкова Корректор С. 1 цекмар Редактор Л, Веселовская Заказ 6468/39 Тираж 778 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Подписное Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул, Проектная, 4 3 12 риал экспонируют в целлоидинах возрастающей густоты (целлоидины 1, 2, , 3) по 3-5 сут, периодически встряхивая.Образцы нервной ткани в загустевшем целлоидине заливают в чашки Петри и после его затвердевания наклеивают на деревянные блоки, которые хранят в 70-ном спирте.Через сутки материал подвергают резке на санном микротоме (толщина среза 4,5-5 мкм) и докрашивают целт лоидиновые срезы толуидиновым синим.При заливке материала в целлоидин достигается наилучшее качество докрашенных гистологических препаратов: видны ярко окрашенные ядра гематогенных макрофагов и глиальных клеток с блеДно-голубой цитоплазмой и осмиефильнаячерного цвета, зернистость.Способ позволяет выявить одновременно с продуктами распада миелина клеточные элементы (лимфоциты, гематогенные макрофаги, нейтрофилоциты, эозинофилы, олигодендроциты, астроциты и микроглию), что является необходимым для излучения патогенеза демиелинизирующих заболеваний нервной системы. 73769 4Способ значительно сокращает сроки диагностики демиелиниэации (прицеллоидиновой проводке в 2 раза,при парафиновой в 5 раз, при получении замороженных срезов более чемв 10 раз).Способ может быть использовандля изучения патоморфологии различных форм рассеяного склероза, а так- О же при исследовании патологическихизменений в нервной системе на экспериментальных моделях профессиональных заболеваний (отравления солямисвинца, бария и др.). Способ окраски нервной ткани нагистологическом препарате путем ее20 обработки бихроматом калия и осмиевой кислотой с последующей докраскойв красителе, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью прокрашивания клеточных элементов в демиелиниэирован 25 ной нервной ткани, обработку бихроматом калия проводят в течение 45-50 ч,а в осмиевой кислоте24-48 ч, приэтом докраску проводят толуидиновымсиним,