Способ подготовки биологических препаратов к микроскопическим исследованиям

(50 4 С 01 Я 1 28 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬГГИЙ(4 б) 30.08.86, Бюл. У 32 (71). Институт проблем криобиологии и криомедицины(54) СПОСОБ ПОДГОТОВКИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ К МИКРОСКОПИЧЕСКИМИ ИССЛЕДОВАНИЯИ(57) Изобретение относится к способам подготовки биологических препаратов к микроскопическим исследованиям. Цель изобретения - исключениеартефактов препарирования при использовании криопротекторов широкогоспектра действия за счет добавления,801254344 А 1 при фиксации к глутаровому альдегиду криопротектора в концентрации, равной исходной. Эритроциты крови инкубируют с 407;-ным раствором пропиленгликоля, Охлаждают, центрифугируют. Центрифугат заливают 43-ным раствором глутарового альдегида на 0,1 М фосфатном буфере, содержащем 407-ный пропиленгликоль, Клетки перемешивают и фиксируют, Затем отмывают в ряду растворов пропиленгликоля на фосфатном буфере. Эритроциты обезвоживают. Суспензию наносят на предметный столик, подсушивают, напыляют в вакууме серебром. Подготовленный препарат исследуют под микро-скопом. 1 табл.0 35 40 45 50 15 Изобретение относнтся к медицине,а именно к способам подготовки имикроскопическим исследованиям биологических препаратов.Целью изобретения является исклю,чение артефактов препарирования прииспользовании криопротекторов широкого спектра действия,Способ осуществляется следующимобразом,При подготовке биологическихобъектов к микроскопическим исследова.ниям, осуществляющей их фиксацию в растворе глутарового альдегида отмывку, постфиксацию растворомосмиевой кислоты, обезвоживание изаключение в смолы., причем, фиксацию осуществляют раствором глутарового альдегида, содержащим исследуемое вещество в концентраций,равной его концентрации в фиксируемомобъекте, затем производят отмывку вряду растворов исследуемого вещества на фосфатном буфере, концентра 11 ию которого ступенчато уменьшаютдо О.П р и и е р 1. Эритроциты кровиинкубируемые. с 403-ным растворомпропиленгликоля, охлаждали до ОМ"С,центрифугировали при 3000 об/мин втечение 5 мин, сливали надосадоки центрифугат заливали пятикратнымобъемом Фиксирующего 47-ного раствора - глутарового альдегида на 0,1 Ифосфатом буфере, содержащем 407 пронилен гликоля, рН 7, 3; 300 мосмоль/кгпо буферу, Клетки суспендировали врастворе черсмешиванием и фиксиро"вали в течение 1 ч, затем отмьэвалив ряду растворов пропиленгликоляна 0,1 М Фосфатном буфере нисходящей концентрации от 40 до 07, при изменении концентрации в каждом последующем растворе на 107, Эритроциты, переведенные таким образом вчистый Фосфатный буфер, обезвоживали в ряду растворов ацетона восходящей концентрации 50, 75 и 1007),после чего суспензию наносили напредметный столик, подсушивали и напыляли в вакууме серебром, Подготовленный препарат исследовали в растровом электронном микроскопе,После обработки предлагаемым спо.собом изменения объема и формы поданнь 1:1 светооптэгГеско 11 1;икроско 11 иине отмечалось. В растровом электронном микроскопе эритроциты имели форму шиповидного эллипсоида, чтосоответствовало предлагаемой реакциизритроцитов на действие высокой концентрации пропиленгликоля,П р и м е р 2. Эритроциты кровичеловека, инкубируемые с 6 ОБ-нымраствором пропиленгликоля, охлаждали до О+4 С, центрифугировали при3000 об/мин в течение 5 мин, сливалинадосадок и центрифугат заливали пятикратным объемом Фиксирующего47.-ного раствора глутарового альдегида на 0,1 И фосфатом буфере,содержащем 607 пропиленгликоля,имеющем рН 7,3 и 300 мосмоль/кг побуферу, клетки суспендировали врастворе перемешиванием и фиксировали в течение 1 ч, затем отмывали вряду растворов пропиленгликоля на0,1 М фосфатном буфере нисходящейконцентрации 60, 50, 40, ЗО, 20,10 и ОЕ). Эритроциты, переведенныев чистый Фосфатный буфер, обезвоживали в ряду растворов ацетона 50, 75и 1007., после чего суспензию наносили на предметный столик, подсушивали и напыляли в вакууме серебром,Подготовленный препарат исследовалив растровом электронном микроскопе.После обработки предлагаемымспособом изменений обьема и Формыэритроцитов по данным светооптической микроскопии не отмечалось. Брастровом электронном микроскопеэритроциты имели форму шиповицногоэллипсоида со складчатой поверхностьюмембран отдельных клеток,П р и м е р 3, Клетки костногомозга, инкубируемые с 157-ным раствором полиэтиленоксида молекулярноймассы 400 ПЭО) охлаждали до О 4 С,центрифугировали при 1000 об/мин втечение 5 мин, сливали надосадок ицентрифугат заливали пятикратнымобъемом Фиксирующего раствора -4 Й-ным глутаровым альдегидом на0,1 М фосфатном буфере, содержащем157-ный раствор ПЭО в 4, ГН 7,3,300 мосмоль/кг по буферу, клеткисуспендировали в растворе перемешиванием и фиксировали в течение 1 ч,затем отмывали в ряду растворовПЭОна 0,1 И фосфатном буференисходящей концентрации: 15, 10, 5и 07. Отмытые клетки постфиксировалив 17.-ном растворе осмиевой кислоты9обезвоживали в ряду растворов ацетона восходящей концентрации 50, 75,1 254344 После инкубации скриопротектором поспособу Исходное сос- тояние рототип Предлагае- мый О,03+0,005 О, 05-0,004Р с 0,05 О, 01+ 0,004 Формула иэ обретения Составитель А. ЛычковаТехред Ч.Моргентал Корректор А, Обручар Редактор А. Гулько Тираж 778 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Заказ 4712/4 б Производственно-полиграфическое предприятие, г. ужгород, ул. Проектная,4 100 .) и заключали в эпонаралдитовуюсмесь,После обработки клеток предлагаемым способом более 90 срезов клеток имели состояние, близкое к нативному. Срезы клеток, претерпевшиеизменения, имели, в осковном, частично просветленный цитозоль,незначительно набухшие каналы эндоплазматической сети. Единичные клетки име- Оли сильно набухшие органеллы и каналы эндоплаэматической сети, расширенное перинуклеарное пространствоно их количество не отличалось отисходного состояния.15 П р и м е р 4, Ткань, щитовиднойжелезы и гипофиэ крысы инкубировали30 мин с 15 ."ным раствором ДМСО прикомнатной температуре. После инкубации Фиксировали 2,57.-ным глютар.альдегидом на фосфатном буфере, содержащем 15 . ДИСО. Дальнейшую подготовку образцов осуществляли в соответствии с прописями использованных способов. Исследования, проведенные на ультратонких срезах вэлектронной микросхеме ЗВМОБВ,показали, что изменение ультрастуктуры состояли в набухании митохон- ЗОдрий и лизосом и в вакуолеобразномрасширении эндоппазматической сети,выраженность которых была незначительной.П р и м е р 5, Спермии карпаинкубируют 15 мин в 15 .-ном раствореДАССО, после инкубации суспензиюцентрифугировали снимали надосадок и фиксировали центрифугат 2,5 -нымглютаральдегидом на Фосфатном буфе ре, содержащем 15 ДМСО, фиксатор добавляли к центркфугату в пятикратном объеме и выдерживали 1 ч при+4 С. Исследования в светооптическоммикроскопе показали наличие лишь 45единичных клеток в поле зрения (кон центрация клеток в 1 мл суспекзниоколо 4 10 ) с разрушенными мембранами, зкачительная часть клеток(больше половины в поле зрения) выглядели иктактными меньшая часть -слабонабухшими,Предложенный способ позволяетустранить артефакты препарированиябиологических препаратов в результате коктакта с различными веществами в произвольной концентрации исохранить морфологические параметры неизменными в течение всего процесса подготовки, Это подтверждаютданные таблицы, в которой представ- .лен средний объем митохондрий,Способ подготовки биологических препаратов к микроскопическим исследованиям путем их фиксации в глутаровом альдеггде с добавлением ком" пенскрующего осмотическое давление вещества, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью исключения артефактов препарирования при исполь- .гзовании криопротекторов широкого спектра действия, при фиксации к глутаровому альдегиду добавляют в качестве компенсирующего вещества криопротектор в концентрации, равной исходной.